劉劍華，張光際，袁橙，盧妍彤

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物醫(yī)學院，江蘇 泰州 225300；2. 泰州職業(yè)技術學院醫(yī)學院，江蘇 泰州 225300)

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)是危害現(xiàn)代集約化養(yǎng)禽生產(chǎn)最嚴重一種寄生蟲[1]。它能引起病雞盲腸腫脹、出血，增重減少，飼料轉(zhuǎn)化率下降，甚至造成死亡。全球每年因雞球蟲病導致的經(jīng)濟損失超104億英鎊[2]。腸道菌群、寄生蟲和宿主三者之間關系密切[3]。腸道菌群可影響寄生蟲在宿主體內(nèi)的入侵和毒力[4]，寄生蟲感染則會引起機體腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡、豐度降低，甚至引發(fā)系列疾病[5]。當前，有關雞球蟲與腸道菌群相互作用的研究較少，大多是評估已知或公認的益生菌對雞球蟲感染的保護效果。球蟲感染后雞腸道菌群的變化及雞腸道內(nèi)是否存在特有益生菌還不清晰。已有研究表明，一些腸道益生菌可治療或預防寄生蟲感染[6-7]。本研究基于16S rDNA測序和糞菌移植技術，分析柔嫩艾美耳球蟲感染后雞盲腸菌群的變化，證實了正常雞腸道菌群對該球蟲感染具有保護作用，確定了益生菌的存在，以期從腸道微生物多樣性角度為雞球蟲病的防制和致病機理研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與蟲株

1日齡海藍褐雛雞購自南京特給力種植專業(yè)合作社雞場，飼養(yǎng)于消毒、無球蟲的環(huán)境中，自由采食和飲水，飼料與飲水中不含抗球蟲藥物。柔嫩艾美耳球蟲卵囊：由南京農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)寄生蟲教研室惠贈，存于濃度為2.5%重鉻酸鉀溶液中，置于4 ℃冰箱中保存，每3～4個月經(jīng)雞體復蘇1次。

1.2 主要試劑

HiPure Stool DNA Kit DNA試劑盒購自Megan公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit 試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 16S rDNA測序分析

1.3.1 分組與攻蟲

將體重相近，體況良好的20只14日齡海蘭褐雛雞隨機平均分為對照組和感染組，感染組的雞在14日齡，每只經(jīng)口接種5×104個新鮮的柔嫩艾美耳球蟲卵囊，對照組灌服同體積生理鹽水。21日齡每組隨機剖殺3只雞，標記為對照組1、對照組2、對照組3、感染組1、感染組2、感染組3，無菌取盲腸內(nèi)容物凍存于液氮中。

1.3.2 盲腸菌群 DNA 提取

使用HiPure Stool DNA Kit盒提取盲腸內(nèi)容物 DNA，具體步驟按照說明書操作；提取好的DNA，用Qubit?dsDNA HS Assay Kit 檢測DNA濃度。

1.3.3 16S rDNA 基因 PCR 擴增及測序

以 20～30 ng DNA為模板，用GENEWIZ公司合成的 PCR 引物(F：5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′，R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′)擴增原核生物16S rDNA上包括V3及V4的2個高度可變區(qū)。通過 PCR 向16S rDNA 的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，以便進行NGS測序。最后 PCR 產(chǎn)物文庫用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用膠回收進行純化，形成測序文庫，通過酶標儀檢測文庫濃度。委托 GENEWIZ，Inc(South Plainfield，NJ)公司利用 Illumina MiSeq/Novaseq平臺進行 PE250/FE300 雙端測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于聚類分析，每1個聚類稱為1個物種可操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)。采用Vsearch(1.9.6)軟件進行序列聚類(序列相似性設為 97%)得到多個可操作分類單元，采用Qiime軟件分析α多樣性指數(shù)，包括菌群豐度的指數(shù)：ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)；菌群多樣性的指數(shù)：Simpson、Shannon，測序深度的指數(shù)：微生物覆蓋率(goods Coverage)。β多樣性分析：采用非加權距離分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異，主坐標分析比較不同樣本在物種多樣性方面存在的相似程度。

1.4 糞菌移植探究雞腸道菌群對球蟲感染的影響

1.4.1 分組與攻蟲

選取將體重相當，體況良好的120只14日齡海蘭褐雛雞隨機分為對照組和感染組(60只/組)，再將感染組平均細分為盲腸內(nèi)容物移植組(20只/組)、糞菌移植組(20只/組)和生理鹽水移植組(20只/組)。盲腸內(nèi)容物移植組、糞菌移植組、生理鹽水移植組在14日齡每只雞均經(jīng)口感染新鮮卵囊5×104個/羽。

1.4.2 菌群移植

感染后1～7 d，每日剖殺對照組5只雞，無菌取新鮮的5 g盲腸內(nèi)容物，加入無菌生理鹽水，配成50 mL 懸液并攪拌均勻。2 000 r/min 離心濾液10 min。將離心后的懸液用經(jīng)過滅菌的3層濾布(紗布、80目濾布、150目濾布)分別進行過濾，最后取均一的10 mL混懸液。將混懸液以500 μL/只經(jīng)口灌胃給盲腸內(nèi)容物移植組。

感染后1～7 d，每日隨機無菌采集新鮮對照組糞便50 g，加入無菌生理鹽水至500 mL，并攪拌均勻。將混懸液經(jīng)2.0 mm的濾網(wǎng)過濾，2 000 r/min 離心濾液10 min。將離心后的懸液用經(jīng)過滅菌的3層濾布(紗布、80目濾布、150目濾布)分別進行過濾，最后取均一的10 mL混懸液，以500 μL/只經(jīng)口灌胃給糞便菌移植組。

感染后1～7 d，每日以500 μL/只無菌生理鹽水經(jīng)口灌胃生理鹽水移植組。

1.4.3 效果判定

感染后第8天，剖殺盲腸內(nèi)容物移植組、糞菌移植組、生理鹽水移植組所有雞以及對照組20只雞，稱重、觀察腸道病變并記分、收集盲腸內(nèi)容物，計算每克腸內(nèi)容物的卵囊數(shù)(oocysts per gram content，OPG)。根據(jù)增重率、存活率、病變記分、卵囊扣分等計算抗球蟲指數(shù)(anti-coccidial index，ACI)[8]來評估效果，公式為：ACI=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。

1.5 統(tǒng)計學分析

計量資料采用R軟件Version 3.5.3進行數(shù)據(jù)分析及處理。獨立樣本正態(tài)分布數(shù)據(jù)且方差齊時采用t檢驗統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)或方差不齊時采用U檢驗統(tǒng)計分析，在單純方差不齊時，P值首選矯正值，只在非正態(tài)時選擇U檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。采用 SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行組間方差分析，Duncan’s 多重比較法進行差異顯著性檢驗，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 可操作分類單元的聚類分析

稀釋曲線出現(xiàn)平臺期提示樣本測序深度達標，當序列接近30 000時再增加序列產(chǎn)生很少新的可操作分類單元(圖1A)，提示試驗測序深度足夠，能反映樣本中絕大多數(shù)微生物信息?？刹僮鞣诸悊卧呢S度聚類熱圖(圖1B)可以看出，與對照組相比，感染組的可操作分類單元聚類豐度明顯變少。通過兩組樣本聚類得到的可操作分類單元差異韋恩圖看出(圖1C)，對照組和感染組共有38個相同可操作分類單元，對照組有86個特征可操作分類單元的，感染組有6個特征可操作分類單元。表明球蟲感染后，雞盲腸內(nèi)菌群豐度降低，雞盲腸內(nèi)菌群紊亂。

A. 樣本稀釋曲線；B. 豐度聚類熱圖；C. 韋恩圖。

2.2 組間α多樣性指數(shù)分析

α多樣性反映單個樣品內(nèi)部的物種多樣性。goods Coverage表示各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，樣本中序列沒有被測出的概率越低，本研究中goods Coverage未見差異(P>0.05)，表明測序深度充分。ACE指數(shù)用來估計群落中含有可操作分類單元數(shù)目，Chao1指數(shù)是用Chao1算法估計樣本中所含可操作分類單元數(shù)目，Shannon用來估算樣本中微生物多樣性，Simpson在生態(tài)學中常用來定量的描述一個區(qū)域的生物多樣性，這些指數(shù)數(shù)值越大，說明樣品物種多樣性越高。與對照相比，感染組ACE、Chao1、Simpson顯著降低(P<0.05)，Simpson下降但差異不顯著，表明感染球蟲后，雞盲腸中菌群豐度和多樣性降低(表1)。

表1 對照組和感染組的α多樣性比較

2.3 組間β多樣性指數(shù)分析

β多樣性是通過各樣本的物種組成及豐度信息來反映樣本間的關系。非加權距離矩陣熱圖中顏色深淺代表了樣本兩兩之間的相異程度，顏色越淺表示兩個樣本相異系數(shù)越小，物種多樣性的差異越小。本研究中對照組和感染組顏色差異較大(圖2A)。主坐標分析中顏色相同的點表示同一分組，點間距離越近提示群落構成差異越小，樣品群落組成越相似。本研究中對照組樣本點和感染組樣本點完全分開，兩組內(nèi)菌群明顯聚集，而不同組間樣本存在顯著差異(圖2B)，可見球蟲感染后，雞盲腸菌群的整體結(jié)構與組成發(fā)生了較大的變化。

A. 非加權距離矩陣熱圖；B. 主坐標分析。

2.4 盲腸菌群組成分析

用可操作的分類單元聚類分析物種相對豐度。在門水平上，對照組和感染組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌、變形菌和放線菌。球蟲感染后，厚壁菌門豐度下降，變形菌門、放線菌門的豐度上升，差異顯著(P<0.05)，感染組出現(xiàn)了擬桿菌門(表2)。在屬水平上，對照組和感染組的優(yōu)勢菌屬如表3所示。與對照組相比，感染組雞盲腸糞便菌群中乳桿菌屬、埃希菌-志賀菌屬、擬桿菌屬、羅姆布茨菌屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬豐度增加但差異不顯著(P>0.05)；而毛螺菌科未定屬、瘤胃球菌屬、梭菌UCG-014、瘤胃球菌科未定屬豐度顯著降低(P<0.05)、GCA-900066575豐度下降但差異不顯著(P>0.05)。

表2 門水平上盲腸微生物豐度

表3 屬水平上盲腸微生物組豐度

用線性判別分析(LDA Effect Size，LEfSe)軟件來尋找組間具有統(tǒng)計學差異的物種。感染組的優(yōu)勢物種有擬桿菌屬(Bacteroides)和腸球菌屬(Enterococcus)，對照組的優(yōu)勢物種有梭菌(Clostridia)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)(圖3A)，并根據(jù)差異物種繪制物種進化分支圖(圖3B)。兩種分析方法的結(jié)果一致。

A. 線性判別分析分析LDA值分布柱狀圖(圖中展示了LDA Score>2的物種，即組間具有統(tǒng)計學差異的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小)；B. LEfSe分析進化分支圖(由內(nèi)至外的圓圈代表了由門至屬(或種)分類級別，在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比)。

2.5 增重變化

用宰殺時重、平均增重、增重率和相對增重率來評估攻蟲后不同的糞菌移植方法對雞的體重增重影響。與對照組相比，3個試驗組的宰殺時重、平均增重均顯著降低(P<0.05)，增重率和相對增重率也下降，說明盲腸內(nèi)容物移植組、糞便菌移植組、生理鹽水移植組的球蟲感染成功。與生理鹽水組相比，盲腸內(nèi)容物移植組和糞菌移植組的宰殺時重、平均增重均顯著升高(P<0.05)，增重率和相對增重率也升高，表明盲腸內(nèi)容物移植和糞菌移植均能減輕球蟲感染后雞增重降低的影響(表4)。

表4 雞體重變化測定結(jié)果

2.6 OPG和盲腸病變記分

與對照組相比，3個試驗組的OPG、平均病變記分顯著升高(P<0.05)，說明說明盲腸內(nèi)容物移植組、糞便菌移植組、生理鹽水移植組的球蟲感染成功。與生理鹽水移植組相比，盲腸內(nèi)容物移植組和糞菌移植組的OPG顯著下降(P<0.05)，病變記分也顯著下降(P<0.05)，說明盲腸內(nèi)容菌移植和糞菌移植都能降低卵囊產(chǎn)量，減輕雞盲腸損傷，(P<0.05)可以對抗球蟲的入侵(表5)。

表5 雞腸道OPG和病變記分

2.7 ACI 結(jié)果

盲腸內(nèi)容物移植組、糞便菌移植組組的ACI分別為173.12和164.38，均大于160，說明盲腸內(nèi)容菌移植和糞菌移植對球蟲感染有一定的抵抗力(表6)。

表6 雞抗球蟲指數(shù)分析

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲入侵雞體后，迅速進入盲腸部位生成滋養(yǎng)體，滋養(yǎng)體通過裂殖生殖產(chǎn)生大量裂殖子，破壞盲腸上皮細胞，引起腸管發(fā)炎，從而引發(fā)盲腸內(nèi)的微生物菌群失調(diào)，使機體的穩(wěn)態(tài)環(huán)境遭到破壞，最終導致雞發(fā)病死亡。因此，雞的腸道菌群在防止病原入侵、參與免疫應答、維持機體生長發(fā)育等方面起著重要作用[9-10]。崔寧[11]、Kley等[12]的研究發(fā)現(xiàn)艾美耳球蟲感染后雞的腸道微生物群落豐度降低，只有少數(shù)優(yōu)勢菌群存在。本研究也得到了同樣的結(jié)果，與對照組相比，球蟲感染雞的盲腸內(nèi)微生物菌群豐度和多樣性顯著降低，菌群穩(wěn)態(tài)失衡。

16S rDNA測序結(jié)果表明，在門水平上，感染組厚壁菌門占比下降、變形菌門和擬桿菌門占比顯著上升。變形菌門是胃腸道中一類適應性強、具有潛在致病性的常見菌，其豐度變化可直接對宿主健康產(chǎn)生影響[13-14]，變形菌門中腸桿菌被證實可加劇球蟲的感染程度[15]，本研究也證實了球蟲感染后腸桿菌比例增加。擬桿菌中有些是有益菌，有些是有害菌，其可長期定殖在宿主腸道中，與宿主共同進化，從而建立一種穩(wěn)定、相互共生的關系[16]。擬桿菌被認為是一類緩解腸道疾病的重要候選益生菌株，例如脆弱擬桿菌可通過誘導機體產(chǎn)生抗炎性的IL-10來緩解腸道炎癥[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的氧化還原水平，為其增長和定殖創(chuàng)造有利的環(huán)境[18]。在本研究中，感染組雞盲腸中擬桿菌門占比顯著上升，推測為抑制球蟲在腸道中的定殖而擬桿菌增加。在屬水平上，感染組盲腸中埃希菌-志賀菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬豐度增加，瘤胃球菌屬、梭菌UCG-014、GCA-900066575、瘤胃球菌科相關屬豐度降低。志賀菌作為一種致病菌可迅速侵入結(jié)腸上皮，引起炎癥反應、破壞結(jié)腸上皮細胞，減退腸道功能，使機體對水、離子和營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良[19]。乳桿菌屬可以產(chǎn)生大量的有機酸抑制腸道菌群生長，還可以通過產(chǎn)生胞外多糖、過氧化氫和細菌素等抑菌蛋白來抑制或殺傷腸道菌群，乳桿菌屬在厭氧或兼性厭氧的環(huán)境下大量繁殖，與雞腸道黏膜上皮細胞緊密結(jié)合形成“占位”，破壞腸道上皮，易于柔嫩艾美耳球蟲入侵腸上皮細胞[20]。擬桿菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬作為常見致病菌，通過產(chǎn)生并釋放膠原酶、產(chǎn)莢膜多糖、溶血素、趨化因子等，進一步促進腹腔膿腫和感染的發(fā)生發(fā)展，引起血便、腹瀉和黏液樣糞便等柔嫩艾美耳球蟲感染的典型臨床癥狀，與本研究中雞感染柔嫩艾美耳球蟲后所表現(xiàn)的臨床癥狀一致[21]。瘤胃球菌屬、毛螺菌科相關菌屬具有能量物質(zhì)代謝、穩(wěn)定腸道屏障、產(chǎn)短鏈脂肪酸鹽發(fā)揮抗炎的作用，感染組雞此類有益菌群豐度降低，進一步促進了感染進程。Tian等[22]研究表明，GCA-900066575和Akkermansia及雙歧桿菌具有一定的正相關性，推測其可維持試驗雞腸道穩(wěn)態(tài)，且Mohamed等[23]研究結(jié)果表明，GCA-900066575作為厚壁菌，可以通過增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收，進而促進雞的體重增長，本研究中各糞菌移植組動物體重變化也得到了同樣的結(jié)果。

本研究利用糞菌移植，將健康雞群的盲腸菌群和糞便菌群移植給感染了柔嫩艾美耳球蟲的雞群，通過增重率、存活率、病變記分、卵囊扣分等計算ACI，結(jié)果表明健康雞群的盲腸內(nèi)容菌和糞便菌移植對球蟲感染有一定的抵抗力，推測健康雞的腸道菌群內(nèi)可能存在益生菌，能對機體產(chǎn)生一定的保護效果。

綜上，柔嫩艾美耳球蟲感染降低了雞盲腸菌群豐度和多樣性，破壞了正常的腸道菌群穩(wěn)態(tài)。雞盲腸的組成和結(jié)構被改變，促使了以埃希菌-志賀菌為代表的致病菌快速生長和定殖，而正常雞盲腸內(nèi)存在著有益菌。設計以這些有益菌為基礎的微生態(tài)制劑，刺激特定微生物的生長，抑制或降低寄生蟲毒力、寄居或繁殖，可為雞球蟲病的防控提供新的方向和技術，對減少抗寄生蟲藥物使用、促進畜牧業(yè)發(fā)展、保障食品安全和人畜健康具有重要意義。