高華義，劉堃，張璐，王永芳，任東興，郭鈺潔，武毅，申雁冰，付旭彬*，王敏*

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308；3. 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461；4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

公豬生長(zhǎng)過(guò)程中，體內(nèi)會(huì)積聚大量雄性激素，使豬肉產(chǎn)生膻味，不僅影響口感、風(fēng)味，還影響生豬飼喂效率，因此公豬往往需要閹割去勢(shì)。該過(guò)程耗費(fèi)大量人力、物力，還容易導(dǎo)致閹割應(yīng)激及外傷感染。自歐盟發(fā)布自愿中止公豬手術(shù)閹割宣言，免疫去勢(shì)替代家畜、寵物的手術(shù)閹割已成必然。

促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)也被稱為黃體生成素釋放激素，由下丘腦神經(jīng)細(xì)胞分泌[1]。該激素形式多種多樣，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24種，主要源自哺乳動(dòng)物、魚(yú)、鳥(niǎo)等動(dòng)物的神經(jīng)組織，GnRH可以通過(guò)刺激垂體合成和分泌促性腺激素，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和生殖有重要的作用[2-3]。通過(guò)對(duì)GnRH進(jìn)行改造修飾，不僅可以解決免疫系統(tǒng)不能識(shí)別自身激素的問(wèn)題，還可以提高GnRH的免疫原性，從而可以起到免疫去勢(shì)作用。在此過(guò)程中，還要特別注意其應(yīng)用場(chǎng)景的需求，公豬免疫去勢(shì)需要維持一定的免疫有效期，以便可以通過(guò)調(diào)控體系發(fā)揮其免疫去勢(shì)作用[4-5]。

Ladd等[6]為了提升GnRH免疫去勢(shì)疫苗的免疫原性，分別將GnRH的第1、6、10位氨基酸與破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行偶聯(lián)結(jié)合，通過(guò)免疫犬、兔子和大鼠，測(cè)定其血清中的抗體效價(jià)，與第6、10位氨基酸鏈接點(diǎn)疫苗相比，GnRH通過(guò)第1位氨基酸與破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行的偶聯(lián)免疫效果最佳。Oonk等[7]通過(guò)用D型氨基酸Lys取代GnRH第6位氨基酸，并將經(jīng)過(guò)修飾后的GnRH進(jìn)行連接形成二聚體，與載體蛋白OVA相連，免疫公豬后，其免疫有效率達(dá)到100%；同時(shí)，通過(guò)用Ala依次替換GnRH的每個(gè)氨基酸，并與載體蛋白偶聯(lián)后免疫公豬，發(fā)現(xiàn)不同位置的氨基酸被取代后，其免疫原性受到的影響不同。作為全球唯一一個(gè)用于公豬免疫去勢(shì)的商業(yè)化產(chǎn)品，美國(guó)碩騰生產(chǎn)的異普克去勢(shì)疫苗是在GnRH的基礎(chǔ)上去掉了第1位的氨基酸，具有一定的免疫活性[8]。除了上述提到的通過(guò)進(jìn)行氨基酸的替代以提升免疫去勢(shì)疫苗的效果，還可以通過(guò)增加抗原分子量，使其抗原表位增多，以多聚體的形式提升其刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力[9]。Oonk等[7]通過(guò)用BSA載體與單個(gè)GnRH連接，之后通過(guò)測(cè)定動(dòng)物血清中睪酮濃度以驗(yàn)證免疫有效率；并且通過(guò)同樣的方式將BSA與串聯(lián)的GnRH進(jìn)行偶聯(lián)結(jié)合，進(jìn)行睪酮濃度的測(cè)定；最后結(jié)果表明，串聯(lián)的GnRH與載體蛋白偶聯(lián)之后形成的新分子免疫有效率可以達(dá)到100%，顯著高于單個(gè)GnRH發(fā)揮的效用。Xu等[10]通過(guò)使用-hinge-MVP作為載體蛋白與單個(gè)GnRH和3個(gè)串聯(lián)的GnRH進(jìn)行連接，通過(guò)測(cè)試其對(duì)大鼠免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)串聯(lián)的GnRH與載體蛋白偶聯(lián)后所發(fā)揮的免疫應(yīng)答反應(yīng)顯著強(qiáng)于單個(gè)GnRH。

基于化學(xué)合成疫苗存在合成工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、批次間質(zhì)控難度高等難題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試使用基因工程方法制備GnRH免疫去勢(shì)疫苗，其自身作為10個(gè)氨基酸的半抗原，半衰期較短，且無(wú)免疫原性，往往需要使用載體蛋白偶聯(lián)修飾。而載體蛋白與單個(gè)GnRH分子的結(jié)合，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，免疫動(dòng)物后，動(dòng)物機(jī)體往往難以有效識(shí)別并將之通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞開(kāi)展免疫應(yīng)答，而GnRH多聚體偶聯(lián)載體蛋白后可以很好的產(chǎn)生免疫去勢(shì)作用。目前通過(guò)基因工程獲取的免疫去勢(shì)疫苗抗原因其表達(dá)量、免疫效果、純化工藝和生產(chǎn)成本等因素，難以大規(guī)模的商業(yè)化應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種適合公豬免疫去勢(shì)、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的免疫去勢(shì)基因工程疫苗，對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖行業(yè)意義重大。本研究采用白喉毒素?zé)o毒突變體(CRM197)與4拷貝GnRH串聯(lián)，制備重組CRM197-GnRH，并分析了其免疫去勢(shì)效果。

1 材料與方法

1.1 試劑

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、dNTPs、DNA Marker、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA純化試劑盒，購(gòu)自于TaKaRa公司；SDS-PAGE Marker，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；His Band Purification Kit，購(gòu)于Novagen公司；BCG購(gòu)于上海瑞楚生物科技有限公司；多肽抗原G1(GnRH+Th抗原表位)、GnRH陽(yáng)性血清來(lái)源于天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司；Montanide ISA 61 VG(油包水佐劑)、Montanide ISA 206 VG(水包油包水佐劑)、Montanide ISA 02 VG(水溶性佐劑)、Montanide IMS 1313 VG(納米水溶性佐劑)，購(gòu)自于法國(guó)SEPPIC 公司；A8佐劑由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；Sim-01佐劑和Bis-01佐劑由清華大學(xué)提供；酵母提取物、蛋白胨，購(gòu)于OXOID 公司(英國(guó))；飽和平衡酚(pH=8.0)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)于南京生興生物技術(shù)有限公司；睪酮放免試劑盒購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所有限公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒和試驗(yàn)動(dòng)物

菌株：大腸桿菌BL21-DE3、大腸桿菌DH5α來(lái)源于天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司。

質(zhì)粒：pET22b(+)(氨芐青霉素抗性，Ampr)，pMD18-T(卡那霉素抗性，Kanr)來(lái)源于天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司。

動(dòng)物：未去勢(shì)的12周齡健康雄性大鼠100只，體重在240～260 g之間，由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供，經(jīng)檢查不存在隱睪和睪丸發(fā)育問(wèn)題。將大鼠隨機(jī)分成10組，每組10只，試驗(yàn)在天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司空港經(jīng)濟(jì)區(qū)分公司動(dòng)物房開(kāi)展，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何抗生素和抗菌藥的全價(jià)鼠糧，至第13周齡開(kāi)始做試驗(yàn)。

1.3 重組CRM197-4GnRH的表達(dá)載體構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)

CRM197-4GnRH基因由深圳華大基因股份有限公司合成，在合成過(guò)程中與pMD18-T載體進(jìn)行了連接，從而得到重組質(zhì)粒pMD18-T-CRM197-4GnRH。用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)pMD18-T-CRM197-4GnRH質(zhì)粒和pET22b(+)載體進(jìn)行雙酶切。采用大腸桿菌BL21按照感受態(tài)細(xì)胞的制備方法予以制備，24 h內(nèi)使用。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行質(zhì)粒的提?。涸贚B平板中挑取5個(gè)單菌落，在LB液體培養(yǎng)基(Amp)中37 ℃培養(yǎng)。取菌液離心，分別加入溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，用等體積堿性飽和平衡酚/氯仿混合，將上清液與等體積氯仿混勻，將沉淀用2倍體積無(wú)水乙醇輕輕混勻沉淀烘干，用20 μL含有RNA酶的TE (TER)溶解質(zhì)粒，37 ℃溫育0.5 h，僅余DNA片段。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，送深圳華大基因股份有限公司測(cè)序。將所測(cè)序的質(zhì)粒以BL(pET22b-CRM197-4GnRH)命名。

將重組菌BL(pET22b-CRM197-4GnRH)置于4 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。用超聲破碎儀將所重懸的菌液處理，取上述所得的上清液80 μL，進(jìn)行SDS-PAGE分析其是否有所需目的蛋白。

1.3.2 優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)條件

挑取重組菌BL單菌落于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h。將所取得的菌液按1%接種量接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)OD600值處于0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，在第0、1、2、3、4、5、6、8、10 h分別吸取1 mL菌液，通過(guò)SDS-PAGE觀察蛋白表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

將所取得的菌液按1%接種量分別接種到含Amp的LB、TB、SOB、TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)OD600值處于0.4～0.6之間時(shí)，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h，吸取1 mL培養(yǎng)的菌液。通過(guò)SDS-PAGE觀察蛋白表達(dá)量，從而確定表達(dá)所用的最佳培養(yǎng)基。

將重組菌BL按上述方法培養(yǎng)后，將其分裝到5個(gè)試管內(nèi)，分別用終濃度0、0.1、0.25、0.5、0.75 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃作用5 h，吸取1 mL培養(yǎng)的菌液。通過(guò)SDS-PAGE觀察蛋白表達(dá)量，從而確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.4 疫苗的配比與免疫

CRM197-4GnRH+Bis-01組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL高壓滅菌的Bis-01佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 02 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+Sim-01組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Sim-01佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+206 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 206 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+A8+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，將A8和Montanide ISA 02 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+BCG+02 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，將BCG和Montanide ISA 02 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，將BCG和Montanide IMS 1313 VG按1∶1比例配制組合佐劑，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的組合佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

CRM197-4GnRH+61 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg CRM197-4GnRH，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 61 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

G1+61 VG組疫苗的制備：稱取10.0 mg多肽抗原G1，溶于90 mL的PBS中，除菌過(guò)濾，取50 mL抗原溶液加入至50 mL 高壓滅菌的Montanide ISA 61 VG佐劑中，充分乳化，疫苗檢驗(yàn)合格后分裝于西林瓶中，濃度為50 μg/mL。

1.5 抗體有效性的效果分析

將動(dòng)物分為空白對(duì)照(A組)、CRM197-4GnRH+Bis-01(B組)、CRM197-4GnRH+02 VG(C組)、CRM197-4GnRH+Sim-01(D組)、CRM197-4GnRH+206 VG(E組)、CRM197-4GnRH+A8+02 VG(F組)、CRM197-4GnRH+BCG+02 VG(G組)、CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG(H組)、CRM197-4GnRH+61 VG(I組)和G1+61 VG(J組)共10組。在大鼠第13周齡之時(shí)進(jìn)行首免，間隔兩周后加強(qiáng)注射1次，每次免疫劑量為50 μg/只，注射體積為1 mL/只；其中空白對(duì)照用等體積的PBS進(jìn)行注射。于第13周齡首免前，眼眶取血法采血0.75 mL，從首免開(kāi)始每隔兩周采血1次直至第31周齡試驗(yàn)結(jié)束。將采集的血樣首先置于室溫條件下0.5 h，之后放置于4 ℃保存過(guò)夜，3 500 r/min離心10 min后，將所得血清置于-20 ℃保存。所有組的免疫注射方式均為背部皮下注射，每組10只。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

把數(shù)據(jù)輸入IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，通過(guò)方差檢驗(yàn)、多重比較分析其顯著性與否。

2 結(jié)果

2.1 重組CRM197-4GnRH蛋白的純化

為了構(gòu)建CRM197-4GnRH重組表達(dá)載體，通過(guò)將CRM197-4GnRH基因連接到了pMD18-T載體，得到了質(zhì)粒pMD18-T-CRM197-4GnRH；用EcoRⅠ、XhoⅠ將pMD18-T-CRM197-4GnRH和pET22b(+)載體進(jìn)行了雙酶切，然后通過(guò)使用Agarose Gel DNA Purification Kit將目的片段CRM197-4GnRH與酶切后pET22b(+)載體的回收；以片段∶載體=5∶1(摩爾比)將目的片段CRM197-4GnRH與pET22b(+)載體的連接；然后將連接載體通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入了感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并通過(guò)堿裂解法提取了質(zhì)粒pET22b-CRM197-4GnRH。經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ的雙酶切鑒定，結(jié)果表明雙酶切有一個(gè)1 827 bp左右的片段(圖1)，與目的片段預(yù)期大小一致，經(jīng)過(guò)測(cè)序表明確為所需目的片段。

通過(guò)挑取重組菌BL及宿主菌BL pET-22b(+)單菌落，加入IPTG誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)。經(jīng)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定最優(yōu)的表達(dá)條件為：誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間5 h，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L。經(jīng)過(guò)最優(yōu)表達(dá)條件的誘導(dǎo)，將沉淀物用原培養(yǎng)基1/10體積的無(wú)菌PBS重懸，將其進(jìn)行了超聲破碎，經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)重組菌表達(dá)產(chǎn)物在65 kDa左右有1條明顯的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合(圖2)。

1. 重組菌菌體蛋白；M. 蛋白Marker；2. 原始菌菌體蛋白對(duì)照。

將誘導(dǎo)表達(dá)重組菌進(jìn)行超聲裂解，用0.5% TritonX-100洗滌后，用8 mol/L的尿素進(jìn)行溶解，將溶解后的融合蛋白CRM197-4GnRH過(guò)His鎳柱，將之前和之后的洗脫液分別用離心管收集，中間5 mL洗脫液所進(jìn)行的洗脫作為所需目的蛋白。將經(jīng)洗脫后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在65 kDa處有明顯條帶(圖3)，與預(yù)期一致，說(shuō)明成功表達(dá)了融合蛋白。

1. 純化后的蛋白；M. 蛋白Marker。

M. 蛋白Marker；1. 純化后的表達(dá)蛋白。

Westem blot分析發(fā)現(xiàn)，所表達(dá)的蛋白可以與大鼠GnRH特異性抗血清發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)顯色后發(fā)現(xiàn)僅有1條清晰條帶(圖4)，表明所獲得的融合蛋白免疫學(xué)活性較好。

2.2 CRM197-4GnRH的免疫原性

通過(guò)間接ELISA 法測(cè)定大鼠免疫后不同時(shí)期血清中GnRH抗體水平，發(fā)現(xiàn)所有的試驗(yàn)組都有較高的、不同水平的抗體滴度值，免疫組抗體滴度與空白對(duì)照組相比較，免疫組大鼠血清抗體滴度均顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明各疫苗組均產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，與預(yù)期一致(圖5)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同佐劑免疫組在二免后4周左右達(dá)到穩(wěn)定峰值，大概持續(xù)10周維持較高水平，然后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。其中水包油包水佐劑組(E組)、油包水佐劑組(I組)、抗原G1油包水佐劑組(J組)免疫去勢(shì)大鼠GnRH抗體滴度顯著高于其他組，但3者內(nèi)部之間差異不大(P>0.05)；此3組自17周齡至27周齡，抗體維持在較高的水平，說(shuō)明水包油包水佐劑和油包水佐劑可以作為免疫去勢(shì)疫苗佐劑。

圖5 大鼠血清GnRH抗體滴度測(cè)定

2.3 免疫大鼠睪酮濃度的測(cè)定

通過(guò)采用放射免疫法測(cè)定大鼠血清中睪酮濃度，以免疫后血清中睪酮濃度<0.1 ng/mL作為疫苗有效與否的判定指標(biāo)(表1和圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第19～31周齡時(shí)，免疫組血清睪酮濃度顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，這說(shuō)明各免疫組均對(duì)免疫去勢(shì)疫苗產(chǎn)生了免疫應(yīng)答；其中，水包油包水佐劑組(E組)、油包水佐劑組(I組)、抗原G1油包水佐劑組(J組)在第17～27周齡時(shí)血清睪酮濃度低于0.1 ng/mL，其有效率均可達(dá)到100%，維持時(shí)間持續(xù)10周時(shí)間，顯著低于其他組(P<0.05)，但3組之間相比差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

表1 免疫后不同時(shí)期有效率統(tǒng)計(jì) %

圖6 免疫后不同時(shí)期對(duì)照組和免疫組血清中睪酮濃度

3 討論

本文通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CRM197-4GnRH抗原進(jìn)行了表達(dá)，采用不同種類佐劑制備疫苗進(jìn)行大鼠的免疫，研究了其對(duì)大鼠的免疫去勢(shì)作用。自從Stewar發(fā)現(xiàn)GnRH之后，朱杰青[11]和Jung等[12]都曾利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行GnRH及其類似物的研究，其中Jung等[12]分別把犬瘟熱病毒的p35蛋白作為載體蛋白與GnRH六聚體基因相連接，同時(shí)將輪狀病毒VP6蛋白作為載體蛋白，將其與6個(gè)串聯(lián)的GnRH基因連接，表達(dá)后的產(chǎn)物對(duì)犬的免疫去勢(shì)作用顯著，與研究預(yù)期一致。本研究中，在預(yù)試驗(yàn)階段嘗試了將CRM197蛋白與抗原G1基因進(jìn)行連接表達(dá)，但表達(dá)量較低，分析有可能是該質(zhì)粒的穩(wěn)定性差或者新型融合蛋白結(jié)構(gòu)受到了空間影響，難以有效表達(dá)[13]。這需要在蛋白的空間結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

為了降低免疫去勢(shì)疫苗批次間質(zhì)控難度，獲得生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的疫苗產(chǎn)品，對(duì)免疫去勢(shì)抗原分子進(jìn)行了精確設(shè)計(jì)，采用白喉毒素突變體CRM197與4拷貝GnRH串聯(lián)，以基因工程方法進(jìn)行免疫去勢(shì)抗原的制備；將CRM197-4GnRH基因與表達(dá)載體連接，酶切鑒定得到了1條1 827 bp的片段，與預(yù)期一致；優(yōu)化了大腸桿菌表達(dá)條件，優(yōu)選表達(dá)條件為：誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)5 h、培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L；將純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在65 kDa處有明顯條帶，與預(yù)期一致；融合蛋白經(jīng)過(guò)Western blot鑒定，在65 kDa處出現(xiàn)1條較為清晰的目的條帶，表明融合蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。

根據(jù)報(bào)道，血清中睪酮濃度<0.1 ng/mL可能是判定疫苗有效與否的指標(biāo)[14]。本試驗(yàn)中，B組所用佐劑為清華大學(xué)所供，為針對(duì)新型通路的新型親油性疫苗佐劑，試驗(yàn)中有效率偏低，不能判定為對(duì)雄性大鼠去勢(shì)免疫增效作用，在該疫苗中其未能達(dá)到免疫增效作用，分析其原因可能是該佐劑特異性針對(duì)新型特定通路，其免疫機(jī)制、激活方式等存在一定的特異性，比如其僅對(duì)特定結(jié)構(gòu)或相應(yīng)受體與之結(jié)合，影響抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。C組為重組疫苗水溶性佐劑組，未能對(duì)雄性大鼠去勢(shì)有免疫增效作用，分析可能是水包油佐劑一般在注射后緩慢形成油包水乳液，可以提供良好的水溶性，便于制備和穩(wěn)定抗原，免疫應(yīng)答反應(yīng)相對(duì)溫和，其一般針對(duì)脂溶性好的抗原或需要更溫和的免疫刺激抗原更加適用，這也是常規(guī)動(dòng)物疫苗往往采取油包水佐劑的原因。D組所用佐劑為清華大學(xué)所供，是針對(duì)于新型通路的新型疫苗佐劑，為親水性佐劑，其未能對(duì)雄性大鼠去勢(shì)有免疫增效作用，可能是由于新型特定通路的免疫機(jī)制、激活方式在不同動(dòng)物個(gè)體中存在差異，或者是其作為水溶性佐劑，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮免疫應(yīng)答反應(yīng)更加溫和，需要更高濃度抗原參與。E組為重組疫苗水包油包水佐劑，該種佐劑有利于疫苗在體內(nèi)的吸收，不易造成潰爛、鼓包等副作用，17～27周齡期間免疫有效率達(dá)到100%，免疫有效期10周以上，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其更易于乳化，制成的疫苗黏度小，且水包油包水更易于吸收，可以作為備選佐劑配比重組疫苗應(yīng)用于公豬免疫去勢(shì)。為了得到更好、更優(yōu)良的佐劑，通過(guò)設(shè)計(jì)了水包油佐劑、納米水溶性佐劑，并從清華大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等取得最新實(shí)驗(yàn)室研究的針對(duì)于新型通路佐劑，并分別嘗試與BCG、A8佐劑等共用，旨在尋找免疫效果好、安全性好、副作用少的市場(chǎng)化佐劑，F(xiàn)、G和H組分別為重組疫苗水溶性佐劑與A8佐劑共用組、重組疫苗水溶性佐劑與BCG共用組和重組疫苗納米水溶性佐劑與BCG共用組，設(shè)計(jì)原則旨在既發(fā)揮免疫增效功能，又能發(fā)揮其親水特性，降低油性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的鼓包、潰爛等問(wèn)題，在本研究中，3種配比佐劑結(jié)果均不理想，未能對(duì)雄性大鼠產(chǎn)生免疫去勢(shì)增效功能。分析可能是水包油佐劑、油包水佐劑共用在乳化過(guò)程中發(fā)生相互作用或不相容現(xiàn)象，導(dǎo)致佐劑的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，影響其在疫苗中的性能，使得乳化后的疫苗無(wú)法提供充分的免疫刺激或抗原的穩(wěn)定性受損。I組為重組疫苗油包水組，其在17～27周齡期間時(shí)對(duì)雄性大鼠免疫有效率達(dá)100%，有效期可以持續(xù)10周以上，可以滿足公豬免疫去勢(shì)有效期時(shí)長(zhǎng)要求，其原因是油包水佐劑作為常規(guī)使用最為廣泛的佐劑，在提供強(qiáng)免疫刺激、促進(jìn)抗原遞呈和處理、誘導(dǎo)免疫記憶以及穩(wěn)定疫苗等方面具有優(yōu)勢(shì)。J組作為陽(yáng)性對(duì)照組，為G1多肽抗原(GnRH+Th抗原表位)油包水組，17～27周齡期間免疫有效率達(dá)到100%，至29周齡時(shí)降至90%，是目前針對(duì)公豬免疫去勢(shì)研究最多的疫苗制備方法，但其往往容易對(duì)動(dòng)物接種區(qū)域造成鼓包、潰爛等副作用，甚至引起動(dòng)物死亡?？傮w來(lái)說(shuō)，E組、I組作為重組GnRH疫苗，可以有效對(duì)雄性大鼠進(jìn)行去勢(shì)，可以作為潛在的公豬用免疫去勢(shì)基因工程疫苗。

綜上，本研究在大鼠體內(nèi)考察了重組去勢(shì)疫苗CRM197-4GnRH的免疫去勢(shì)效果，將融合蛋白分別與不同佐劑乳化，制備了CRM197-4GnRH+Bis-01疫苗、CRM197-4GnRH+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+Sim-01疫苗、CRM197-4GnRH+206 VG疫苗、CRM197-4GnRH+A8+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+BCG+02 VG疫苗、CRM197-4GnRH+BCG+1313 VG疫苗、CRM197-4GnRH+61 VG疫苗和G1+61 VG疫苗，測(cè)定了免疫后大鼠體內(nèi)GnRH抗體滴度和睪酮水平，發(fā)現(xiàn)水包油包水佐劑組CRM197-4GnRH+206 VG、油包水佐劑組CRM197-4GnRH+61 VG疫苗和油包水佐劑組G1+61 VG疫苗可以顯著提升大鼠體內(nèi)GnRH抗體滴度，并抑制大鼠體內(nèi)睪酮水平，顯著優(yōu)于其他組。通過(guò)重組去勢(shì)疫苗對(duì)大鼠免疫作用的研究，為GnRH免疫去勢(shì)基因工程疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。