張財盛，陳歡，司安琪，趙普，齊傳翔，錢鶯娟，鄭龍三，戴建君

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/教育部動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

豬流行性腹瀉病毒(porcine Epidemic Diarrhea virus，PEDV)是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，可感染各個年齡段的豬，其中，對哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，死亡率高達(dá)100%。PEDV屬于α-冠狀病毒，極易發(fā)生突變[1-2]。高致病性PEDV自2010年底在我國豬場大規(guī)模暴發(fā)后，呈持續(xù)流行趨勢。美國、日本和韓國也相繼發(fā)生嚴(yán)重疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。近年來，多種突變株在不同地區(qū)不斷出現(xiàn)，突破現(xiàn)有疫苗保護(hù)，加劇了防控難度[3-4]。

依福地平是一種L型和T型鈣離子通道阻滯劑，化學(xué)名為：5-(5，5-二甲基-2-氧代-1，3，2-二氧雜環(huán)己-2-基)-1，4-二氫-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3-吡啶羧酸-2-[苯基(芐基)氨基]已酯[5-6]。依福地平是由日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司和澤里亞新藥公司聯(lián)合研發(fā)，于1994年首次在日本上市。該藥常用于原發(fā)性高血壓、腎性高血壓、心律失常、心力衰竭和心絞痛的治療。除此之外，最新研究表明，依福地平還可用于地中海貧血患者鐵螯合療法中鐵螯合劑的替代藥物，且副作用小[7-9]。目前，對于依福地平的抗病毒效果的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)依福地平在體外具有抗PEDV、Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)和偽狂犬病毒(PRV)的活性，是一類廣譜抗病毒藥物，并初步探索了依福地平抑制PEDV感染的作用階段，為后續(xù)研究依福地平抗病毒感染的機(jī)制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero-E6和Marc-145以及豬腎細(xì)胞系PK-15均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病毒

豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株和CV777毒株，Ⅰ型單純皰疹病毒HSV-F毒株和偽狂犬病毒JSY13毒株，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 抗體及其他試劑

抗體：PEDV-N兔多克隆抗體、PRV-UL42鼠多克隆抗體和HSV-UL42鼠多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。actin抗體購自美國Proteintech Group公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購自美國Millipore公司。

其他試劑：依福地平購自美國Selleck公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自美國APExBio公司；多聚甲醛購自德國MERCK公司；TMB顯色液購自中國天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Biological公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)購自美國Invitrogen公司；青霉素-鏈霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰酶購自美國Amresco公司。蛋白Marker和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(Enhanced Chemiluminesce-nce，ECL)購自美國Thermo公司；RNA提取試劑盒購自上海浦迪生物科技有限公司；半定量RT-PCR試劑盒和2×RapidTaqMaster Mix購自南京諾維贊生物科技股份有限公司，其他試劑均為分析純。

1.4 藥物的細(xì)胞毒性測定

以1.5×104個細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到96孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。棄掉原培養(yǎng)基，用PBS潤洗3遍。然后向96孔板中加入100 μL含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基，每個藥物濃度設(shè)置3個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)14 h。棄掉含有藥物的培養(yǎng)基，用PBS潤洗3遍。然后，在避光條件下，向96孔板中每孔加入100 μL含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中放置2 h。最后，在搖床上緩慢搖晃5 min后，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度，使用以下公式計算藥物的細(xì)胞毒性：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As表示試驗(yàn)孔的吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8和待測化合物孔的吸光度)，Ab表示空白孔的吸光度(含有培養(yǎng)基和CCK-8孔的吸光度)，Ac表示對照孔的吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8和二甲基亞砜孔的吸光度)。

1.5 藥物的抑制率測定

以1.5×104個細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到96孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。棄掉原培養(yǎng)基，用PBS潤洗3遍。然后向96孔板中加入100 μL含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基，每個藥物濃度設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄掉培養(yǎng)基并用PBS潤洗3遍，隨后向96孔板中加入100 μL含不同濃度藥物以及1倍感染復(fù)數(shù)(MOI)病毒的不完全培養(yǎng)基。將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。棄培養(yǎng)基用PBS潤洗3遍，隨后加入100 μL含不同濃度藥物的病毒維持培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至12 h。棄培養(yǎng)基并用PBS潤洗3遍，每孔加入100 μL多聚甲醛固定液，37 ℃固定30 min。棄掉固定液，用Glycine-PBS溶液潤洗3遍，再用PBS潤洗3遍，隨后加入3%的BSA并置于37 ℃培養(yǎng)箱封閉1 h。棄封閉液，以100 μL/孔的量加入一抗，37 ℃繼續(xù)孵育1 h。回收一抗并用PBS潤洗3遍。以100 μL/孔的量加入二抗，37 ℃孵育1 h。棄去二抗并用PBS潤洗3遍。以50 μL/孔的量加入TMB顯色液，室溫避光顯色30 min。每孔加入50 μL 2% H2SO4溶液終止顯色。最后在搖床上緩慢搖晃5 min后，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度，使用以下公式計算藥物的抑制率：藥物的抑制率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As表示試驗(yàn)孔的吸光度(不同濃度藥物處理細(xì)胞感染病毒孔的吸光度)，Ab表示空白孔的吸光度(只含有顯色液和終止液的孔的吸光度)，Ac表示對照孔的吸光度(二甲基亞砜處理細(xì)胞感染病毒孔的吸光度)。使用OriginPro?2022統(tǒng)計學(xué)軟件繪圖并計算出半抑制濃度(IC50)。

1.6 Western blot檢測

用適量2×SDS緩沖液裂解細(xì)胞，98 ℃煮樣10 min后即樣品準(zhǔn)備完畢。按照目的蛋白大小配制不同濃度的SDS-PAGE凝膠，將SDS-PAGE凝膠裝置于電泳槽內(nèi)，并在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，隨后將制備的蛋白樣品加入膠孔內(nèi)，當(dāng)樣品處于濃縮膠時，電泳儀電壓為50 V；當(dāng)樣品處于分離膠時，調(diào)節(jié)電壓至120 V。電泳結(jié)束后，根據(jù)目的蛋白大小及蛋白Marker剪切凝膠、NC膜和濾紙。按正極到負(fù)極的順序放置濾紙-NC膜-蛋白凝膠-濾紙，并加入轉(zhuǎn)印液，以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將NC膜置于抗體孵育盒內(nèi)，用3%脫脂牛奶在室溫封閉40 min。棄去封閉液，用3%脫脂乳稀釋的目的蛋白一抗在4 ℃搖床孵育過夜?；厥找豢?，用PBST洗膜3次以去除未結(jié)合的一抗，每次洗膜時間分別為10 min、10 min和15 min；再加入3%脫脂乳稀釋的二抗，置于4 ℃搖床孵育4～6 h，回收二抗，用PBST洗膜3次以去除未結(jié)合的二抗，洗膜方法同上。用濾紙吸凈NC膜上殘余PBST，然后將ECL A液與B液1∶100混合后浸潤NC膜，最后將NC膜置于 UVP發(fā)光成像儀中進(jìn)行顯影成像。

1.7 半定量RT-PCR

按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。半定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中12.5 μL 2×TaqMaster Mix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，1 μL cDNA和9.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，72 ℃ 5 min，共20個循環(huán)。用于半定量RT-PCR的引物序列如表1所示。

表1 半定量RT-PCR引物序列

1.8 藥物直接靶向病毒試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)中常用的藥物直接靶向病毒試驗(yàn)[10-11]，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。

將Vero-E6細(xì)胞按照5×105個/孔接種到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h，棄營養(yǎng)液，用PBS潤洗3遍。將1 MOI HLJBY病毒液與不同濃度的藥物混合，在37 ℃孵育1 h，隨后使用2 mL無血清DMEM稀釋病毒與藥物的混合液，將稀釋后的混合液加入到6孔板中，37 ℃孵育1 h，PBS潤洗3遍。每孔加入2 mL PEDV維持培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至12 h，棄掉培養(yǎng)基，用PBS潤洗3遍。加入適量2×SDS上樣緩沖液收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blot檢測病毒蛋白PEDV-N表達(dá)水平。

1.9 藥物抑制病毒吸附試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)中常用的藥物抑制病毒吸附試驗(yàn)[11-13]，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。

將Vero-E6細(xì)胞按照8×105個/孔接種到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h，棄掉營養(yǎng)液，PBS潤洗3遍，換成含有藥物的細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，其中1 h在37 ℃，另外1 h在4 ℃(在4 ℃條件下，細(xì)胞膜變脆性，PEDV粒子只能吸附在細(xì)胞表面，而不能入胞)。棄掉培養(yǎng)基，用4 ℃ PBS潤洗3遍，接著用1 MOI HLJBY 感染細(xì)胞，并處理藥物，在4 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。隨后棄去培養(yǎng)基，用4 ℃ PBS 潤洗3遍，充分洗掉未吸附在細(xì)胞表面的病毒粒子。隨后使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行半定量RT-PCR試驗(yàn)檢測細(xì)胞中病毒蛋白PEDV-N mRNA水平。

1.10 藥物抑制病毒入胞試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)中常用的藥物抑制病毒入胞試驗(yàn)[11-13]，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。

將Vero-E6細(xì)胞按照8×105個/孔接種到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞培養(yǎng)板在4 ℃預(yù)冷1 h后用4 ℃ PBS潤洗3遍，并用1 MOI HLJBY在4 ℃吸附細(xì)胞1 h，隨后用4 ℃ PBS潤洗3遍，將未吸附在細(xì)胞表面的病毒粒子洗去，接著處理藥物，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h使病毒入胞。隨后，使用pH=3的檸檬酸鹽緩沖液潤洗3遍，再用PBS潤洗3遍，洗去未能入胞的病毒粒子。最后，每孔加入2 mL PEDV維持培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用PBS潤洗3遍，加入適量2×SDS上樣緩沖液收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blot檢測病毒蛋白PEDV-N表達(dá)水平。

1.11 依福地平對不同MOI HSV-1和PRV復(fù)制影響的檢測

將Vero-E6細(xì)胞和PK15細(xì)胞按照8×105個/孔接種到6孔板，37 ℃培養(yǎng)12 h，棄營養(yǎng)液，PBS潤洗3遍，將0.1、0.5和1 MOI HSV-1或PRV與10 μmol/L藥物混合，37 ℃培養(yǎng)1 h，PBS潤洗3遍，加入2 mL藥物繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再進(jìn)行Western blot檢測。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組試驗(yàn)設(shè)立3個重復(fù)，并利用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 依福地平的細(xì)胞毒性及對PEDV有效抑制濃度的測定

采用CCK-8法測定依福地平對Vero-E6和Marc-145細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明，在Vero-E6(圖1A)和Marc-145細(xì)胞(圖1B)中，依福地平濃度低于20 μmol/L時，細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞存活率保持在90%以上。

圖1 依福地平對Vero-E6(A)和Marc-145細(xì)胞(B)的毒性測定

采用基于細(xì)胞的 ELISA測定依福地平對PEDV的抑制率。結(jié)果表明，在Vero-E6細(xì)胞中，依福地平對PEDV HLJBY和CV777毒株的IC50分別為13 μmol/L(圖2A)和11 μmol/L(圖2B)；在Marc-145細(xì)胞中，依福地平對PEDV HLJBY和CV777毒株的IC50分別為13 μmol/L(圖2C)和6 μmol/L(圖2D)。選取細(xì)胞毒性較低且抑制效果較明顯的藥物濃度(10 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)研究。

A. Vero-E6細(xì)胞中依福地平對HLJBY的抑制率；B. Vero-E6細(xì)胞中依福地平對CV777的抑制率；C. Marc-145細(xì)胞中依福地平對HLJBY的抑制率；D. Marc-145細(xì)胞中依福地平對CV777的抑制率。

2.2 依福地平抑制PEDV病毒蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證依福地平對PEDV的抑制作用，如圖3A所示，用藥物處理細(xì)胞并感染不同MOI 的PEDV。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明，依福地平可以顯著降低PEDV HLJBY毒株和CV777毒株感染Vero-E6細(xì)胞(圖3B、C)和Marc-145細(xì)胞(圖3D、E)中PEDV-N蛋白的表達(dá)水平。

A.藥物處理細(xì)胞和感染病毒示意圖，黑色虛線表示藥物處理細(xì)胞，黑色實(shí)線表示接種病毒；B、C.依福地平對不同MOI HLJBY和CV777毒株感染Vero-E6細(xì)胞中N蛋白表達(dá)的影響；D、E.依福地平對不同MOI HLJBY和CV777毒株感染Marc-145細(xì)胞中N蛋白表達(dá)的影響。“-”代表未加藥，“+”代表加藥，下同。

2.3 依福地平不直接靶向PEDV病毒粒子

抗病毒藥物主要是通過藥物直接靶向病毒粒子或通過靶向宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的防御系統(tǒng)來發(fā)揮抗病毒作用。因此，首先通過藥物直接靶向病毒試驗(yàn)，檢測藥物是否可以直接靶向PED病毒粒子。如圖4A所示，用藥物處理細(xì)胞并感染PEDV。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組與對照組病毒蛋白PEDV-N表達(dá)水平無明顯變化，表明依福地平抑制PEDV感染不直接靶向病毒粒子(圖4B)。因此，下一步從藥物靶向宿主細(xì)胞的角度，研究依福地平抑制PEDV病毒感染的機(jī)制。

A.藥物處理細(xì)胞和感染病毒示意圖，黑色虛線表示藥物處理細(xì)胞，黑色實(shí)線表示感染病毒；B. 依福地平直接靶向PED病毒粒子Western blot分析。

2.4 依福地平抑制PEDV感染階段的測定

PEDV的復(fù)制周期主要包括病毒的吸附、入胞、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、組裝和釋放的過程。通過時間過程分析試驗(yàn)測定依福地平抑制PEDV生命周期的具體階段。如圖5A所示，用藥物處理細(xì)胞并感染1 MOI的PEDV。蛋白印跡試驗(yàn)表明，在感染過程中和感染后給藥都會降低病毒蛋白PEDV-N的表達(dá)水平，但在病毒入胞階段給藥，病毒蛋白PEDV-N的下降最明顯(圖5B)，表明依福地平主要抑制病毒生命周期的早期階段。

2.5 依福地平對PEDV入胞的抑制作用

PEDV病毒感染的早期階段包括病毒的吸附階段和入胞階段。根據(jù)圖6A(藥物抑制病毒吸附試驗(yàn))和圖6C(藥物抑制病毒入胞試驗(yàn))處理細(xì)胞，進(jìn)一步確定依福地平對PEDV吸附和入胞的影響。藥物抑制PEDV吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，依福地平對PEDV-N的mRNA水平?jīng)]有影響(圖6B)；在藥物抑制PEDV入胞試驗(yàn)中，依福地平可以顯著降低PEDV感染細(xì)胞中PEDV-N蛋白水平(圖6D)。綜上，依福地平可以抑制PEDV入胞。

2.6 依福地平對其他病毒的抑制作用

為測定依福地平是否可以抑制其他病毒如HSV-1和PRV感染宿主細(xì)胞，首先采用CCK-8法測定依福地平對PK15細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在PK15細(xì)胞中，依福地平在藥物濃度低于20 μmol/L時，細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞存活率保持在90%以上(圖7A)。

A.依福地平對PK15細(xì)胞的毒性測定；B.藥物處理細(xì)胞和感染病毒的示意圖；C. 依福地平對不同MOI HSV-1感染Vero-E6細(xì)胞中病毒蛋白UL-42蛋白表達(dá)的影響；D. 依福地平對不同MOI PRV感染PK15細(xì)胞中病毒蛋白UL-42蛋白表達(dá)的影響。

隨后，驗(yàn)證了依福地平對HSV-1和PRV的抑制作用，如圖7B所示，用藥物處理細(xì)胞并感染不同MOI的HSV-1和PRV。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明，依福地平可以顯著降低HSV-1感染Vero-E6細(xì)胞和PRV感染PK15細(xì)胞中病毒蛋白UL42的表達(dá)水平。由此可見，依福地平不僅可以抑制冠狀病毒(PEDV)還可以抑制皰疹病毒(HSV-1和PRV)感染宿主細(xì)胞，是一類潛在的廣譜抗病毒藥物。

3 討論

近年來，PED頻頻暴發(fā)給我國乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在抗PEDV藥物方面，蘆薈、槲皮素、甘草酸和銀杏果提取物等被證明在體外具有抗PEDV的活性，但這類藥物多局限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚未有有效商品化藥物可用于PED的預(yù)防與治療[16-19]。目前已經(jīng)研制出多種PED疫苗，并應(yīng)用到臨床，在一定程度上控制了PED流行，但由于PEDV頻繁變異，使得現(xiàn)有的疫苗無法完全控制PED疫情的暴發(fā)，有些疫苗免疫過的豬場PED疫情仍時常發(fā)生。因此研究和開發(fā)新型疫苗與具有抗PEDV活性的藥物具有重要意義。

本研究首先在PEDV易感細(xì)胞Vero-E6和Marc-145中測定依福地平細(xì)胞毒性和對PEDV的半數(shù)有效濃度，最終選取一個細(xì)胞毒性較低且對PEDV具有明顯抑制效果的藥物濃度(10 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)研究。通過Western blot檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了藥物對PEDV的抑制效果，發(fā)現(xiàn)依福地平能夠有效降低細(xì)胞中病毒蛋白PEDV-N的表達(dá)量?？共《舅幬镏饕峭ㄟ^藥物直接靶向病毒粒子或通過靶向宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的防御系統(tǒng)來發(fā)揮抗病毒作用[14]。因此，本試驗(yàn)首先通過藥物直接靶向病毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)依福地平并不能直接靶向病毒粒子，隨后從藥物靶向宿主細(xì)胞的角度考慮，設(shè)計了時間過程分析試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在病毒感染前、感染過程中和感染后處理藥物都能夠降低病毒蛋白PEDV-N的表達(dá)量，但在病毒感染過程中給藥抑制效果最為明顯，表明依福地平主要抑制PEDV感染的早期階段。隨后，通過藥物抑制病毒吸附試驗(yàn)和藥物抑制病毒入胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在依福地平能夠抑制PEDV入胞而不能夠抑制PEDV的吸附階段。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)依福地平也可以降低皰疹病毒(HSV-1和PRV)感染宿主細(xì)胞中病毒蛋白UL42水平。

綜上所述，本研究證明依福地平能夠在體外抑制PEDV、HSV-1和PRV感染宿主細(xì)胞，是一種潛在的廣譜抗病毒藥物。后續(xù)應(yīng)進(jìn)行動物試驗(yàn)，驗(yàn)證依福地平在易感動物體內(nèi)是否具有抗PEDV、HSV-1和PRV的活性。