方天，李喬斌，馮孝傲，朱二鵬，2，陳常秀，程振濤，2*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省動物疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550008)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科、禽腺病毒屬[1]。根據(jù)群特異性抗原特征將禽腺病毒分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群和12個血清型，又根據(jù)系統(tǒng)進化樹、基因組分為A～E 5個基因型[2]。安卡拉病毒屬于I群禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)，基因型為C型，感染雞后其特征性病變?yōu)樾陌e液-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)[3]，病理變化是黃色心包積液、腫脹，肝臟壞死、有點狀出血，其對家禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[4-5]。HHS最初于1987年報道在巴基斯坦卡拉奇發(fā)生，在1年內(nèi)迅速傳播到巴基斯坦其他地區(qū)，隨后在南美洲和亞洲暴發(fā)，包括伊拉克、日本、智利、韓國和中國[6]。該病多發(fā)于3～5周齡的肉雞，死亡率在30%～70%之間，最高可達80%，且死亡率隨著雞日齡的增大而降低，成年蛋雞死亡率一般不超過10%，發(fā)病雞群產(chǎn)蛋率下降10%～30%[7]。開展對HHS的診斷、預防和治療研究是防控本病的必要手段，基于FAdV-4病毒結構蛋白的診斷方法、新型疫苗開發(fā)、抗體類分子制劑等研究多建立于目的蛋白的分子特征分析、蛋白表達與純化、抗體制備的基礎上，是防控HHS的技術關鍵。五鄰體蛋白(Penton)和纖絲蛋白(Fiber1)是FAdV-4主要結構蛋白之一，Penton對病毒粒子在細胞中的裝配和維持病毒粒子的結構和病毒侵入細胞方面發(fā)揮作用，在不同血清型間較為保守[8]；Fiber1能夠直接與宿主細胞受體結合，可介導病毒內(nèi)化，在病毒感染細胞時綁定細胞，影響病毒的致病性，F(xiàn)iber1蛋白與Penton base相連伸出[9]。目前對FAdV-4主要結構蛋白的研究較多，但并無針對相關蛋白的成熟商品化疫苗推出，對FAdV-4主要結構蛋白的致病機理、免疫效果的探索仍是當下研究的主題。

本試驗基于FAdV-4結構蛋白Penton和Fiber1分子特征分析，選擇N端優(yōu)勢抗原表位基因片段進行原核表達，獲取純化蛋白并制備其多克隆抗體，最后對多克隆抗體效價、重組蛋白的免疫原性和反應原性作出評價，可為FAdV-4結構蛋白生物學功能研究、診斷試劑盒研發(fā)以及臨床藥物治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、菌種、載體和質(zhì)粒

6～8周齡BALB/c小鼠購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心；pCold Ⅰ載體、DH5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自上海碧云天生物技術有限公司；pMD19-T-Penton克隆載體、pMD19-T-Fiber1克隆載體由貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨購自OXOID公司；2×TaqPCR Master Mix、T4連接酶、HindⅢ、BamHⅠ、pMD-19T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；E.Z.N.A.?Plasmid kit 質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega BIO-TEK公司；蛋白純化試劑盒、山羊抗小鼠IgG HRP、His小鼠單抗、聚丙烯酰胺凝膠試劑盒、5×SDS蛋白上樣緩沖液均購于上海碧云天生物技術有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Penton和Fiber1蛋白生物信息學分析

應用在線軟件ProtParam分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白的基本理化性質(zhì)；應用在線軟件DETAIBIO分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白信號肽和跨膜區(qū)；應用DNAStar軟件包Protean分析Penton、Fiber1蛋白B細胞抗原表位的親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)；應用軟件SOPMA與SWISSMODEL分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白二級結構與三級結構。

1.2.2 FAdV-4 Penton和Fiber1基因表達載體構建

1.2.2.1 引物設計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的FAdV基因序列(登錄號：GU188428)，應用Primer Pemier 5.0軟件設計合成兩對引物，分別擴增Penton和Fiber1，命名為pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1，引物序列見表1，預期擴增片段大小分別為717 bp和366 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.2.2 目的基因擴增、克隆與陽性重組質(zhì)粒篩選

使用質(zhì)粒DNA提取試劑盒從保存的菌液中提取pMD19-T-Penton克隆載體、pMD19-T-Fiber1克隆載體質(zhì)粒DNA，以各自的質(zhì)粒DNA為模板，按以下反應擴增：預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。擴增結束后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。使用膠回收試劑盒切膠回收目的基因，將回收產(chǎn)物與pColdⅠ空載體分別應用對應的內(nèi)切酶37 ℃酶切過夜，回收酶切過的目的片段并與pColdⅠ使用T4連接酶4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉化入DH5α感受態(tài)細胞，后置于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，挑取單個菌落接種含Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行PCR與雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 Penton和Fiber1重組蛋白的原核表達

1.2.3.1 蛋白表達形式驗證

將測序鑒定成功的陽性重組質(zhì)粒轉入BL21(DE3)感受態(tài)細胞培養(yǎng)過夜，擴大培養(yǎng)后加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，誘導表達目的蛋白，取菌液離心后將PBS洗滌凍融后的沉淀超聲波裂解，分別收集上清液和沉淀，上清液需要咪唑洗脫液進行洗脫，沉淀則需要咪唑脲素(50 mmol/L)洗脫，取適量樣品用12% SDS-PAGE分析其蛋白表達形式。

1.2.3.2 Penton和Fiber1重組蛋白純化

采用結合His-tag標簽的蛋白純化試劑盒純化后進行SDS-PAGE分析與Western blot鑒定，將細菌裂解液、上樣穿流液、洗滌液、洗脫液制樣后進行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE參考步驟如下：組裝制膠模具并參照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配置濃縮膠，待濃縮膠凝固后配置分離膠并轉移在玻璃夾層內(nèi)，將裂解的蛋白混合蛋白上樣緩沖液后在沸水中放置10 min后，每泳道20 μL上樣量于孔中，將SDS-PAGE緩沖液倒入電泳槽中，在樣品進入分離膠之前80 V恒壓，之后100 V恒壓直跑到凝膠底部。從膠板中取出凝膠，置于染色容器內(nèi)，加入考馬斯亮藍染色液，染色30 min。倒掉染色液后并用去離子水清洗后，并加入100 mL脫色液脫色至背景清晰。

Western blot參考步驟如下：經(jīng)SDS-PAGE后按照膠塊大小裁剪PVDF膜，安裝好轉印夾后放入垂直電泳槽中，加入適量轉膜緩沖液100 mA恒流轉印3 h，結束后取出PVDF膜使用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入適當比例稀釋的His小鼠單抗37 ℃搖床孵育1 h，加入HRP標記山羊抗鼠IgG HRP酶標二抗37 ℃搖床孵育1 h，中間使用TBST洗滌，最后用DAB底物顯色溶液對PVDF膜顯色，紅外掃描儀掃描PVDF膜觀察結果。

1.2.4 Penton、Fiber1蛋白多克隆抗體制備

1.2.4.1 動物免疫與血清收集

采用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的蛋白進行蛋白濃度測定，按免疫劑量為200 μg/只免疫小鼠。將制備的重組蛋白與弗氏佐劑等體積混勻，采用皮下注射免疫。第1次免疫14 d后進行第2次免疫，7 d后進行第3次免疫；3次免疫后對小鼠進行眼球采血，離心后收集血清。

1.2.4.2 多克隆抗體Western blot鑒定與ELISA抗體效價測定

將純化重組蛋白Penton、Fiber1分別進行SDS-PAGE，分別使用制備的Penton和Fiber1多克隆抗體進行Western blot分析，在印跡試驗中將一抗換成Penton、Fiber1多克隆抗體，HRP標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，試驗步驟同1.2.3.2。

應用ELISA方法對血清抗體進行效價測定，將酶標板放入酶標儀里面，在OD450進行讀數(shù)，根據(jù)吸光值來判斷多克隆抗體的效價。ELISA試劑盒具體操作步驟如下：將純化好的蛋白用包被液來稀釋成10 μg/mL，在酶標板上每孔加入100 μL，4 ℃孵育過夜。倒掉酶標孔中的液體，然后使用洗滌液(1×PBST)洗滌5次，每次3 min，最后1次在吸水紙上拍干。加入封閉液每孔200 μL，37 ℃孵育2 h。再次洗滌，加入稀釋好的待測血清100 μL，轉移到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱1 h。繼續(xù)洗滌后加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000倍稀釋)每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。再洗滌，最后加入顯色液A 和顯色液B 各50 μL，混勻，避光顯色10 min，最后加50 μL終止液終止反應。結果判定：以P/N值(陽性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽性；P/N值小于2.1，但大于或等于1.5為可疑；P/N值小于1.5為陰性。

2 結果

2.1 目的蛋白的生物信息學分析

應用生物分析軟件分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白的基本理化性質(zhì)，信號肽，跨膜區(qū)，B細胞抗原表位的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原指數(shù)(圖1)，二級結構及三級結構。由表2可知，F(xiàn)AdV-4Penton基因完整開放閱讀框為1 578 bp，共編碼525個氨基酸，理論等電點(pI)為5.03，總平均親水性(GRAVY)為-0.300，推測該蛋白為酸性親水蛋白(pI<7，判定酸性；pI>7，判定堿性)(GRAVY負值的絕對值越大，親水性越高)，不穩(wěn)定系數(shù)(II)為46.30(II>40，不穩(wěn)定；II<40，穩(wěn)定)推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。FAdV-4Fiber1基因完整開放閱讀框為1 299 bp，編碼432個氨基酸，pI為4.77，GRAVY為-0.120，推測該蛋白為酸性親水蛋白；II為35.89，推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白。軟件分析結果顯示，Penton和Fiber1蛋白均無跨膜區(qū)，進行原核表達時不用考慮將跨膜區(qū)去除；均無信號肽，不能分泌到胞外。

FAdV-4 Penton蛋白二級結構中α-螺旋占比15.4%，β-轉角占比7.43%，無規(guī)則卷曲和延長鏈占比77.17%，無β-折疊；在5～23、65～76、163～171、216～227、366～375、 452～462、486～490肽段共有7個B細胞表位，且該連續(xù)線性表位均位于肽段的無規(guī)卷曲和延長鏈處，很可能是FAdV-4 Penton的優(yōu)勢抗原表位區(qū)域。由圖1B可知，F(xiàn)AdV-4 Fiber1蛋白二級結構中α-螺旋占比6.48%，β-轉角占比6.25%，無規(guī)則卷曲和延長鏈占比87.27%，無β-折疊；在15～24、32～49、223～230、302～309、327～332、352～358肽段共有6個B細胞表位，且該連續(xù)線性表位同樣位于肽段的無規(guī)卷曲和延長鏈處，很可能是FAdV-4 Fiber1的優(yōu)勢抗原表位區(qū)域。FAdV-4 Penton和Fiber1蛋白都是以無規(guī)則卷曲和延長鏈為主，α-螺旋和β-轉角為輔。無規(guī)則卷曲和轉角散在存在，提高了目的蛋白充分與周圍的極性環(huán)境相接觸，為抗原表位的形成提供了有利條件。

2.2 Penton、Fiber1基因表達載體構建

2.2.1 目的基因PCR擴增

以pMD19-T-Penton克隆載體、pMD19-T-Fiber1克隆載體為模板，擴增Penton、Fiber1基因目的片段。由圖2和圖3可見，PCR能擴增出與預期目的基因大小相符的特異性目的片段條帶。

M. DL2000分子質(zhì)量標準；1～5. 質(zhì)粒pMD19-T-Penton；6. 陰性對照。

M. DL2000分子質(zhì)量標準；1～4. 質(zhì)粒pMD19-T-Fiber1；5. 陰性對照。

2.2.2 陽性重組質(zhì)粒PCR鑒定

將重組質(zhì)粒pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1使用所設引物與反應條件進行PCR擴增。由圖4和圖5可見，能擴增出與預期目的基因大小相符的片段。

M. DL2000分子質(zhì)量標準；1. 陽性對照；2～5. 重組質(zhì)粒pColdⅠ-P；6. 陰性對照。

M. DL2000分子質(zhì)量標準；1. 陽性對照；2. 重組質(zhì)粒pColdⅠ-F1；3. 陰性對照。

2.2.3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

分別對pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重組質(zhì)粒使用兩組限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ與HindⅢ、HindⅢ與XbaⅠ)進行酶切鑒定。由圖6和圖7所示，均出現(xiàn)雙酶切條帶，重組質(zhì)粒pColdⅠ-P、pColdⅠ-F1目的條帶分別717 bp、366 bp。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證，與預期相符，說明重組原核表達質(zhì)粒構建成功。

M. DL5000分子質(zhì)量標準；1～3. 重組質(zhì)粒；4. 空載體對照。

M. DL5000分子質(zhì)量標準；1～2. 重組質(zhì)粒；3. 空載體對照。

2.3 Penton和Fiber1重組蛋白的原核表達

2.3.1 重組蛋白表達形式驗證

將離心收集的蛋白樣品取20 μL使用SDS-PAGE分析其蛋白表達形式。由圖8和圖9可見，重組菌pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1在沉淀中表達，表明Penton蛋白和Fiber1蛋白主要為包涵體表達。

M. 180 kDa預染蛋白；1. pColdⅠ-P誘導沉淀；2. pColdⅠ-P誘導上清液。

M. 180 kDa預染蛋白；1. pColdⅠ-F1誘導沉淀；2. pColdⅠ-F1誘導上清液。

2.3.2 重組蛋白純化與鑒定

將純化后的目的蛋白使用SDS-PAGE和Western blot檢測。由圖10和圖11可見，重組蛋白Penton、Fiber1純化后電泳分別出現(xiàn)31.8 kDa、16.5 kDa的蛋白條帶，無雜蛋白條帶，說明均已成功純化。由圖12和圖13可知，Western blot印跡目的條帶分別為31.8 kDa、16.5 kDa，與預期相符，說明所純化得到的蛋白為帶有His標簽的目的蛋白。

M. 120 kDa預染蛋白；1. 上樣穿流液；2～3. 洗滌液(0.2 mmol/L咪唑脲素)；4～8. 洗脫液(50 mmol/L咪唑脲素)

M. 120 kDa彩色預染蛋白；1. 上樣穿流液；2～3. 洗滌液(0.2 mmol/L咪唑脲素)；4～7. 洗脫液(50 mmol/L咪唑脲素)。

1. 陰性對照；2.帶His標簽的重組蛋白Penton。

1. 陰性對照；2. 帶His標簽的重組蛋白Fiber1。

2.4 Penton、Fiber1蛋白多克隆抗體效價測定及Western blot鑒定

2.4.1 重組蛋白濃度測定

采用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的蛋白進行濃度測定，用酶標儀測定OD630處的吸光值，根據(jù)測定樣品的吸光值推算出重組蛋白Penton和Fiber1蛋白濃度分別為3.371 μg/μL和1.235 μg/μL。

2.4.2 多克隆抗體Western blot鑒定

以重組蛋白Penton和Fiber1作為抗原進行Western blot鑒定。由圖14和圖15所見，重組蛋白Penton制備的多克隆抗體能夠特異性識別31.8 kDa條帶，重組蛋白Fiber1制備的多克隆抗體能夠特異性識別16.5 kDa條帶，與預期結果相符。

1. 陰性對照；2. Penton蛋白。

2.4.3 多克隆抗體效價測定

應用ELISA方法對小鼠血清抗體進行效價測定，結果如表3、表4所示，Penton多克隆抗體的效價在1∶3 200以上，而 Fiber1多克隆抗體的效價在1∶1 600倍稀釋時為陽性，稀釋至1∶3 200時P/N值為可疑，重組蛋白Penton的血清抗體效價大于Fiber1。說明重組蛋白Penton較Fiber1具有更高的免疫原性。

表4 重組蛋白Fiber1多克隆抗體效價檢測

3 討論

基因序列的生物信息學分析有助于了解編碼蛋白的結構與成分，為目的蛋白的體外表達、應用等奠定基礎。通過生物信息學分析，明確蛋白理化性質(zhì)、抗原表位，可為亞單位疫苗、抗體制備提供有效的數(shù)據(jù)基礎[10]。本研究使用生物信息學分析預測出Penton蛋白的親水性能力大于Fiber1蛋白，更有利于將其以可溶性蛋白形式表達。有研究分析了FAdV-4主要結構蛋白的二級結構、三級結構，并預測了各蛋白潛在的B細胞、CTL細胞、Th細胞抗原表位[11]。因蛋白結構與氨基酸組成不同，F(xiàn)AdV-4 Penton蛋白優(yōu)勢抗原表位點區(qū)域分布較為均勻，含有FAdV-4的主要抗原表位和中和抗體的識別表位，該蛋白免疫雞后可誘導有效的免疫保護，證實該蛋白可用于亞單位疫苗的研制及單克隆抗體的制備[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Penton抗體可以阻斷病毒體從酸性的核內(nèi)質(zhì)進入細胞漿，從而使病毒感染性失活，因此Penton蛋白的高效表達對診斷試劑、抗病毒藥物及疫苗的制備研究等都具有重要意義[13]。Fiber1在氨基酸N端擁有最高的抗原性、柔韌性、親水性和表面可及性，相關研究將攜帶Fiber1、Fiber2突變基因的腺病毒質(zhì)粒轉染雞LMH細胞，F(xiàn)iber1突變的重組病毒無法拯救，而Fiber2組則成功拯救，證實Fiber1對介導病毒吸附至關重要，而該區(qū)域可能是病毒粒子與細胞膜上受體結合的位點[14]。本研究通過原核表達載體pColdⅠ實現(xiàn)FAdV-4 Penton、Fiber1重組蛋白大量表達，可為后續(xù)動物免疫提供優(yōu)勢抗原，但表達的Penton、Fiber1重組蛋白均為包涵體表達，與楊華、羅思思等[15-16]試驗結果一致。有研究將Penton基因全序列克隆至pCold-SUMO表達載體中，成功高效表達出可溶性Penton蛋白，關于Penton、Fiber1重組蛋白親水性對比需進一步驗證。

多克隆抗體在病原的檢測和疾病治療上具有重要價值[17]。以FAdV-4全病毒滅活抗原為診斷抗原存在易散毒、制備繁瑣、成本高等缺點，而使用原核表達系統(tǒng)表達出的人工抗原易于純化與標準化，成本低且無散毒風險[18]。研究FAdV-4衣殼蛋白多克隆抗體可為后續(xù)FAdV-4檢測方法的開發(fā)及其相關致病機制的研究奠定物質(zhì)基礎[19]。本研究應用ELISA方法對制備的鼠源Penton、Fiber1多克隆抗體進行了效價測定，Penton多克隆抗體在1∶3 200倍稀釋時仍有很高的免疫原性，而Fiber1多克隆抗體效價僅為1∶1 600，說明重組蛋白Penton比Fiber1具有更高的免疫原性，可作為制備亞單位疫苗的優(yōu)勢抗原。

綜上所述，本研究對Penton和Fiber1基因優(yōu)勢抗原片段序列進行擴增并克隆至pColdⅠ表達載體，成功在大腸桿菌中獲得了高效表達，通過免疫小鼠后測定其血清抗體效價，證實Penton重組蛋白具有良好的免疫原性，為后續(xù)亞單位疫苗或單克隆抗體研發(fā)奠定了基礎。