李彩霞，劉盼盼，陳曉慧，羅小鳳，王桂琴

(寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

耐藥菌株引起的高發(fā)病率和病死率已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人和動(dòng)物的生命安全，并已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起奶牛乳房炎主要的致病菌之一，抗菌藥物的使用仍為奶牛乳房炎主要治療手段。我國奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離株耐藥性嚴(yán)重，80%～90%菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國家，部分省區(qū)90%以上金黃色葡萄球菌分離株耐藥[2]。地區(qū)不同，耐藥也有很大區(qū)別。從新疆地區(qū)分離出的菌株對(duì)青霉素耐藥率高達(dá)93.0%，浙江地區(qū)分離出的菌株對(duì)青霉素耐藥率為77.35%[3]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)的耐藥機(jī)制包括靶位改變、鈍化酶產(chǎn)生、主動(dòng)外排等，其中抗生素作用靶位的改變是最主要的耐藥機(jī)制。細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖合成是由青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)催化完成，金黃色葡萄球菌通?？僧a(chǎn)生4種PBPs，即PBP1、PBP2、PBP3和PBP4，它們參與細(xì)胞壁的合成并在細(xì)菌細(xì)胞周期中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。PBPs具有轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase，TPase)活性和轉(zhuǎn)糖基酶(glycosyltransferase，TGase)活性，而β-內(nèi)酰胺類藥物能與PBPs轉(zhuǎn)肽酶功能域選擇性結(jié)合，使TPase失活[4]。MRSA菌株中存在可移動(dòng)遺傳元件葡萄球菌盒式染色體mec(SCCmec)，該元件攜帶mecA基因，編碼具有轉(zhuǎn)肽酶活性的青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)蛋白[5]。PBP2a蛋白包含3個(gè)功能區(qū)，其中N末端跨膜區(qū)(1～23 aa)將PBP2a固定在細(xì)胞膜表面，非青霉素結(jié)合區(qū)(24～326 aa)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的延伸和固定，轉(zhuǎn)肽酶區(qū)(327～668 aa)發(fā)揮轉(zhuǎn)肽酶活性。PBP2a的轉(zhuǎn)肽酶區(qū)含有β-內(nèi)酰胺類抗生素作用的低親和力位點(diǎn)，與β-內(nèi)酰胺類藥物難以結(jié)合，當(dāng)其他PBPs被抑制時(shí)，PBP2a可代替其功能，完成肽聚糖合成，維持細(xì)菌正常生長。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AP)是一類多靶點(diǎn)的萜類小分子化合物，具有多種生物活性，如抗炎和抗菌等作用[6-7]。AP與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用可以增強(qiáng)MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性[8]。而PBP2a為MRSA關(guān)鍵耐藥蛋白，那么是否AP通過影響PBP2a表達(dá)及功能進(jìn)而使金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物增敏？為探究這一科學(xué)問題，本研究首先通過生物信息學(xué)及分子模擬等手段分析PBP2a的蛋白分子特性及AP與PBP2a蛋白的作用及其結(jié)合模式，探究AP對(duì)PBP2a蛋白功能的影響；隨后，測定了AP作用下PBP2a轉(zhuǎn)錄水平變化；通過原核表達(dá)純化PBP2a蛋白，制備多克隆抗體，檢測AP對(duì)PBP2a表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌參考菌株ATCC33591購自中國藥品與生物制品檢定所，試驗(yàn)菌株為本實(shí)驗(yàn)室從寧夏不同地區(qū)奶牛場乳房炎乳樣中分離出的MRSA(WLD10、WLD1、XF2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡成年新西蘭大白兔，購自四川里來思諾生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

穿心蓮內(nèi)酯，純度99.89%，購自美國Med Chem Express公司；TRIzol試劑購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜(DMSO)和0.2 μm PVDF膜均購自德國Merck公司；熒光定量試劑購自美國ABclonal公司；內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液試劑購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司；異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自北京索萊寶科技有限公司；Ni2+親和層析柱購于上海生工生物工程有限公司；BCA蛋白含量檢測試劑購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；脫脂奶粉購自美國BD公司。

1.4 熒光定量PCR檢測AP對(duì)mecA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

選擇4株MRSA菌株ATCC33591、WLD10、WLD1、XF2劃線培養(yǎng)，挑取單菌落過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，按1∶100的比例稀釋，然后分別加至終濃度為0、64、128、256 μg/mL的AP，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。使用TRIzol法提取總mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。以gyrB為內(nèi)參基因，使用SYBR Green Real-time熒光PCR預(yù)混液在20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)。利用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理[9]，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.5 蛋白分子結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件NPS@:SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)PBP2a蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。采用在線服務(wù)器Consurf Web Serve(http://consurf.tau.ac.il/)進(jìn)行同源性建模和保守性分析[10]。利用PyMOL軟件將保守性氨基酸映射到PBP2a蛋白的三維結(jié)構(gòu)上，并分析氨基酸保守性與蛋白結(jié)構(gòu)和功能的聯(lián)系。

1.6 分子對(duì)接

采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，獲得PBP2a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。將能量最小化的優(yōu)勢構(gòu)象作為PBP2a蛋白對(duì)接的初始構(gòu)象。AP小分子結(jié)構(gòu)文件來源于PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，隨后利用PyMOL軟件將結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)化為PDB格式。使用AutoDock對(duì)蛋白去水、加氫、計(jì)算電荷以及設(shè)置小分子的旋轉(zhuǎn)鍵等預(yù)處理后進(jìn)行半柔性分子對(duì)接。最終選取兼顧打分和構(gòu)象契合的最優(yōu)結(jié)果，使用BIOVIR Discovery Studio 2020進(jìn)行可視化[11]。

1.7 動(dòng)力學(xué)模擬

進(jìn)一步驗(yàn)證AP與PBP2a蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性。分子對(duì)接后，以PBP2a-AP復(fù)合物作為初始構(gòu)象，使用Gromacs 2020版本對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬(molecular dynamics simulation，MD)[12]。此處，MD模擬的分子力場選擇為OPLS3e，并使用TIP3水模型對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行溶劑化，通過添加離子對(duì)系統(tǒng)電荷進(jìn)行中和，整個(gè)系統(tǒng)的能量最小化是使用全原子型OPLS3e力場來實(shí)現(xiàn)[13]。水分子的幾何結(jié)構(gòu)、重原子的鍵長和鍵角都是通過SHAKE算法來約束[14]。通過應(yīng)用周期性邊界條件對(duì)連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行模擬，并通過粒子網(wǎng)格Ewald方法維持長程靜電[15]。在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬之前先對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化：(1)限制溶劑，進(jìn)行能量最小化；(2)沒有限制，能量最小化；(3)溫度10 K，Berendsen熱力學(xué)方法，運(yùn)行12 ps，每1 ps重新采樣1次；(4)NPT系綜，溫度300 K，壓力1.01×105Pa，正常壓力釋放系數(shù)，運(yùn)行24 ps[16]；(5)MD成品：前期準(zhǔn)備結(jié)束后，以1.2 fs的時(shí)間進(jìn)行100 ns的運(yùn)行，每25 ps進(jìn)行一次軌跡記錄，總計(jì)記錄4 000幀。計(jì)算PBP2a蛋白及復(fù)合物主鏈原子的均方根偏差(RMSD)，衡量復(fù)合物體系的穩(wěn)定性；以均方根波動(dòng)(RMSF)反映蛋白氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)柔性；通過回旋半徑(Rg)考量AP對(duì)PBP2a蛋白結(jié)構(gòu)折疊緊密度的影響，捕捉PBP2a與AP間氫鍵數(shù)目及持續(xù)時(shí)間主鏈原子的RMSD，以了解蛋白質(zhì)-配體相互作用的性質(zhì)。

1.8 PBP2a蛋白的原核表達(dá)

1.8.1mecA基因的PCR擴(kuò)增

從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載mecA基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，并送至生工生物工程股份有限公司合成。在引物兩端加入限制性酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基，目的基因上游引物序列為：5′-CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCA-3′，下游引物序列為：5′-GGAATTCGCAACCCACGTTACCGGATTG-3′，Prime STAR Max DNA Polymerase 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并膠回收目的片段。引物序列下劃線處分別為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

1.8.2 重組質(zhì)粒pET28a-mecA的構(gòu)建

將回收目的片段及質(zhì)粒pET28a經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后使用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，經(jīng)卡那霉素篩選及PCR鑒定獲得陽性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.8.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-mecA轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，PCR鑒定獲得陽性菌落，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.4 重組蛋白PBP2a的誘導(dǎo)表達(dá)

將新鮮的單菌落挑取至5 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB過夜培養(yǎng)，1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL卡那霉素抗性LB。37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(1 mmoL，1∶1 000)誘導(dǎo)劑，160 r/min，25 ℃誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.8.5 重組蛋白的鑒定

同1.8.4方法制備樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，120 V轉(zhuǎn)印PVDF膜，用5%脫脂奶4 ℃封閉過夜，一抗為抗His標(biāo)簽抗體(1∶2 000稀釋)，孵育1 h后TBST緩沖液洗4次，每次10 min；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL顯色。

1.9 PBP2a多克隆抗體的制備

1.9.1 重組蛋白純化

同1.8.4方法小量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，離心取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，以相同條件大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，使用Ni2+親和層析柱進(jìn)行純化。然后進(jìn)行最適洗滌濃度確定，20、50、75、100、150、250 mmol/L咪唑緩沖液洗滌，確定目的蛋白不被洗脫的最大咪唑濃度為最佳洗滌濃度。

1.9.2 免疫程序

第一次免疫使用弗氏完全佐劑與0.2 mg的重組蛋白進(jìn)行等體積乳化，背部皮下多點(diǎn)注射，在一免后14 d進(jìn)行二免，28 d進(jìn)行三免，二免、三免使用弗氏不完全佐劑。

1.9.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測抗體特異性

含有pET28a-mecA的質(zhì)粒并誘導(dǎo)后的大腸桿菌作為對(duì)照，同時(shí)使用MRSA菌株制備樣品，以制備的抗重組蛋白PBP2a的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，鑒定多克隆抗體對(duì)重組PBP2a蛋白和MRSA源PBP2a的特異性。

1.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測AP作用下PBP2a蛋白含量的變化

過夜培養(yǎng)MRSA菌株WLD10，1∶100接種至TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入AP使各管濃度分別為0、64、128、256 μg/mL，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日將菌液濁度調(diào)整至OD600=1.0，用超聲儀破碎。使用BCA法測定蛋白含量，將蛋白總含量稀釋一致后使用5×loading Buffer進(jìn)行金屬浴加熱10 min，樣品制備完成進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗(PBP2a蛋白多克隆抗體)，孵育二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，ECL顯影檢測蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR分析mecA基因轉(zhuǎn)錄水平

經(jīng)64、128、256 μg/mL濃度的AP處理，MRSA菌株ATCC33591、WLD10、WLD1、XF2中mecA基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)(P<0.01)，且隨著AP濃度的升高，4株菌mecA的轉(zhuǎn)錄水平均逐漸降低(圖1)。

**表示與對(duì)照組(0 μg/mL AP)比較P<0.01。下同。

2.2 PBP2a蛋白分子特征分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，PBP2a蛋白為單體及二聚體結(jié)構(gòu)，含有33.98% α螺旋、18.11% 延伸鏈、7.93% β轉(zhuǎn)角、39.97% 無規(guī)則卷曲。利用Consurf服務(wù)器進(jìn)行保守性分析，通過PyMOL軟件將保守性和溶劑可及性賦值投影至三維結(jié)構(gòu)上，從而關(guān)聯(lián)保守性氨基酸與結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。結(jié)果顯示，Met1-Lys3、Asp156-Asn158、Ser261-Lys265、Thr354-Leu360、Val361-Tyr369、Ser462-Arg469、Leu514-Gly520、Ile595-Lys604、Gln613-Ile618區(qū)域和GLU 284、ASP288殘基高度保守。氨基酸溶劑可及性通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測，其中包含多個(gè)埋藏于蛋白內(nèi)部用于維持結(jié)構(gòu)特異性的高度保守性殘基，它們分別是Val45、Tyr46、Trp127、Ile154、Leu264、Tyr373、Phe395、Ala471等氨基酸殘基；Met1、Arg65、Thr103、Gly106、Ile132、Arg150、Gly151、ASP288、Gln333、Ser437等保守殘基位于PBP2a蛋白表面，可能在生物學(xué)功能發(fā)揮中起到至關(guān)重要的作用。

2.3 AP和PBP2a蛋白的結(jié)合模式分析

對(duì)接結(jié)果的3D、2D結(jié)合構(gòu)象可視化見圖2，AP與蛋白PBP2a的GLU170、GLU239和THR238殘基形成4個(gè)氫鍵，并通過烷基間分子作用力與殘基VAL277、PRO258結(jié)合、與殘基TYR373形成π-烷基堆積作用力，結(jié)合能顯示PBP2a蛋白與AP小分子具有較強(qiáng)結(jié)合能力。

圖2 分子對(duì)接結(jié)果3D(A)、2D(B)展示

A.PBP2a-AP復(fù)合物的RMSD；B.表示復(fù)合物的RMSF；C.PBP2a-AP配合物的Rg；D.表示PBP2a和AP的氫鍵數(shù)。

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

為進(jìn)一步研究AP分子與PBP2a蛋白的相互作用，本研究對(duì)PBP2a-AP復(fù)合物進(jìn)行了100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。如圖3A所示，復(fù)合物的RMSD小于4.5?，而且復(fù)合物在較短的(18 ns)時(shí)間內(nèi)達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，這表明AP與靶蛋白PBP2a能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。根據(jù)圖3B可知，大部分的氨基酸構(gòu)象變化較小，AP分子可通過結(jié)合降低PBP2a蛋白中殘基的結(jié)構(gòu)柔性。這也是復(fù)合物RMSD變化較小的主要原因。氫鍵在復(fù)合物形成中的作用也很關(guān)鍵，形成的氫鍵越多，兩者將具有更強(qiáng)的結(jié)合活性，再結(jié)合Rg，Rg越小，表明AP對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)折疊的影響越輕微。從圖3C和圖3D可知，小分子與蛋白結(jié)合良好，能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物從而實(shí)現(xiàn)小分子其活性功能。在整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬過程，活性位點(diǎn)殘基的結(jié)合情況可反映PBP2a蛋白與配體AP間更詳盡的能量細(xì)節(jié)。根據(jù)結(jié)合能(表2)可以看到，蛋白的GLU145，GLU170，ASN164，ASP275，VAL277，GLU284，ASP288，ASP295，TYR373等氨基酸貢獻(xiàn)的結(jié)合自由能最為突出，特別是與VAL277結(jié)合能達(dá)到 -6.78 kJ/mol，位于PBP2a蛋白的功能區(qū)氨基酸TYR373結(jié)合自由能達(dá)到-5.199 4 kJ/mol(圖4)，對(duì)穩(wěn)定蛋白口袋中的小分子有著重要作用，另一方面也表明了分子與蛋白位點(diǎn)存在的這些作用可有效促使小分子牢牢地錨定在蛋白活性位點(diǎn)，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

圖4 與配體相互作用的每個(gè)蛋白質(zhì)殘基的結(jié)合自由能的分解

表2 結(jié)合能及其所選生物活性分子的組成能

2.5 PCR擴(kuò)增mecA片段

mecA基因PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示，在1 000 bp附近存在條帶，與預(yù)期1 026 bp符合。

M. DL2000 Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.6 重組質(zhì)粒pET28a-mecA的酶切鑒定

提取的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定結(jié)果如圖6所示。重組質(zhì)粒的mecA基因序列未出現(xiàn)突變和移碼，表明原核表達(dá)載體pET28a-mecA成功構(gòu)建。

M. DL10000 Marker；1.重組質(zhì)粒雙酶切；2.重組質(zhì)粒。

2.7 重組蛋白PBP2a的表達(dá)

通過不斷優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，發(fā)現(xiàn)在1 mmol/L的IPTG濃度下，低溫25 ℃誘導(dǎo)24 h可獲得目的蛋白。經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測PBP2a蛋白的N端His標(biāo)簽，特異性反應(yīng)條帶約為38 kDa，見圖7，與預(yù)期結(jié)果相符。

M. 蛋白Marker；1.PBP2a重組蛋白。

2.8 重組蛋白PBP2a的純化

重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用超聲破碎儀破碎后，離心分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)沉淀和上清液都存在目的蛋白，取上清液經(jīng)Ni2+純化柱進(jìn)行純化，最佳洗滌的咪唑濃度為75 mmol/L，用150 mmol/L的咪唑?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行洗脫，獲得大小約38 kDa的目的蛋白(圖8)。

M. 蛋白Marker；1～6.75 mmol/L咪唑洗滌蛋白；7～9.150 mmol/L咪唑洗脫蛋白。

2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡分析PBP2a蛋白多克隆抗體的特異性

使用制備的抗重組蛋白PBP2a的多克隆抗體對(duì)PBP2a重組蛋白及MRSA菌株中的PBP2a蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)性分析。如圖9所示，在38 kDa左右出現(xiàn)特異性目的條帶，表明該多克隆抗體可與原核表達(dá)的PBP2a蛋白及MRSA菌株中的PBP2a蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)PBP2a蛋白表達(dá)量的檢測。

M. 蛋白Marker；1.重組蛋白PBP2a；2.MRSA菌內(nèi)PBP2a蛋白。

2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測AP作用下PBP2a蛋白含量的變化

將經(jīng)0、64、128、256 μg/mL的AP處理的MRSA菌株，標(biāo)定總蛋白含量制樣，蛋白質(zhì)免疫印跡測定PBP2a的蛋白含量變化。結(jié)果如圖10所示，在38 kDa左右處出現(xiàn)目的條帶，與未處理的MRSA菌株內(nèi)PBP2a蛋白相比，經(jīng)處理的PBP2a蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，且隨著AP濃度的升高，PBP2a的表達(dá)量逐漸降低。

圖10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測PBP2a蛋白表達(dá)量

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為威脅全球公共衛(wèi)生健康的重要因素之一，革蘭陽性和陰性菌中的多重耐藥模式導(dǎo)致傳統(tǒng)抗菌劑難以治療甚至無法治療[17]。 MRSA幾乎耐所有的β-內(nèi)酰胺類藥物，且對(duì)多種抗生素耐藥，引起的感染也極難治療。因此，開發(fā)有效的抗MRSA感染治療策略或抑制劑對(duì)治療至關(guān)重要。隨著對(duì)植物抗微生物成分的探索，一些候選藥物表現(xiàn)出潛在的抑菌活性，被認(rèn)為是安全、無毒、不易產(chǎn)生副作用的天然化合物，因此被廣泛應(yīng)用于研究[18-19]。

PBPs在細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖合成中發(fā)揮作用[20]。 PBPs主要參與肽鉸鏈橋的形成，催化鄰近糖鏈，肽側(cè)鏈之間的特定交聯(lián)來輔助細(xì)胞壁的合成。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素使PBPs失去活性時(shí)，PBP2a卻能代替其功能繼續(xù)完成肽聚糖的合成，使細(xì)菌可以繼續(xù)生長，并呈現(xiàn)高度耐藥性[21]。因此，抑制PBP2a的功能，進(jìn)而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成是使MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類增敏的可能途徑。

AP是穿心蓮的主要活性成份，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌并治療多種疾病，在體內(nèi)和體外有廣泛的治療作用，具有大量藥理學(xué)靶點(diǎn)[22]。本試驗(yàn)通過熒光定量PCR測定發(fā)現(xiàn)，不同濃度AP處理的MRSA菌株mecA基因的轉(zhuǎn)錄水平均有下調(diào)，且具有濃度依賴；進(jìn)一步通過原核表達(dá)及抗體制備獲得PBP2a重組蛋白及其多克隆抗體，經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證，表明AP可以通過抑制mecA基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來抑制PBP2a蛋白。

分子模擬在很多研究中被用于篩選抗金黃色葡萄球菌的有效分子[23-24]。本試驗(yàn)采用半柔性分子對(duì)接及全原子動(dòng)力學(xué)模擬來探究AP與PBP2a蛋白的相互作用及結(jié)合模式，其中分子對(duì)接結(jié)果顯示，AP會(huì)與PBP2a形成4個(gè)氫鍵，還存在烷基間分子作用力，同時(shí)，會(huì)在π-烷基堆積作用力下形成復(fù)合物，這些氨基酸殘基與AP結(jié)合可能會(huì)損害其生物學(xué)功能，且氫鍵的出現(xiàn)對(duì)復(fù)合物的形成至關(guān)重要，幾乎起到?jīng)Q定性作用[22]。其中TYR373殘基位于PBP2a蛋白的功能區(qū)，AP與TYR373殘基的結(jié)合會(huì)使PBP2a蛋白無法發(fā)揮其轉(zhuǎn)肽酶功能。這些結(jié)果都說明AP對(duì)PBP2a蛋白有一定抑制潛力。分子動(dòng)力學(xué)模擬被認(rèn)為是一項(xiàng)分析蛋白質(zhì)配體相互作用的關(guān)鍵技術(shù)，為了分析AP和PBP2a蛋白結(jié)合的可靠性，將AP-PBP2a復(fù)合物進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合物的RMSD小于4.5?，復(fù)合物RMSD變化較小，Rg也在比較小的范圍內(nèi)波動(dòng)，這些都說明AP-PBP2a復(fù)合物比較穩(wěn)定。再結(jié)合活性位點(diǎn)殘基的結(jié)合情況分析，小分子與蛋白位點(diǎn)的氨基酸存在很好的氫鍵以及疏水相互作用，其中殘基GLU284，ASP288是高度保守的殘基，AP與其結(jié)合可能使PBP2a蛋白的生物學(xué)功能受到影響；與VAL277殘基的結(jié)合能達(dá)到 -6.78 kJ/mol，結(jié)合能越低對(duì)穩(wěn)定蛋白口袋中的小分子有著重要作用，與功能區(qū)氨基酸TYR373結(jié)合能達(dá)到-5.199 4 kJ/mol。以上分析說明AP對(duì)MRSA主要耐藥蛋白PBP2a存在抑制作用，并顯示出巨大的潛力。

綜上，本研究從分子模擬的角度提出了AP與PBP2a蛋白存在結(jié)合效應(yīng)，揭示了AP對(duì)PBP2a的抑制潛力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AP下調(diào)mecA轉(zhuǎn)錄水平，并抑制MRSA菌株中PBP2a蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性?？傊珹P可抑制PBP2a蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并有可能會(huì)損壞其構(gòu)象來提高M(jìn)RSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。