呂世琪，馬曉菲，周榮艷，陳曉勇

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000)

顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成成分，可分泌多種卵泡發(fā)育所需的因子調(diào)控卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、成熟和閉鎖。顆粒細(xì)胞的存活與否、存活狀況能夠直接影響卵泡的發(fā)育過程和是否正常發(fā)生閉鎖反應(yīng)。綿羊一生中大約有106個(gè)卵泡，而大部分的卵泡會(huì)在體內(nèi)發(fā)生閉鎖，喪失排卵和激素釋放功能[1]。引起卵泡閉鎖的主要原因是顆粒細(xì)胞的凋亡[2]。顆粒細(xì)胞凋亡涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、死亡受體和線粒體三個(gè)途徑，但主要是由線粒體途徑導(dǎo)致的，半胱氨酸蛋白酶家族(caspase家族)是線粒體凋亡途徑的最后執(zhí)行者，在細(xì)胞中以非活性狀態(tài)存在，直到細(xì)胞凋亡被觸發(fā)[3]。線粒體會(huì)釋放多種蛋白質(zhì)，比如細(xì)胞色素C從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這一途徑會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。研究表明，在赤霉烯酮的作用下，雞原代顆粒細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活，自噬水平升高，促進(jìn)細(xì)胞色素C的產(chǎn)生及釋放，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞中線粒體為主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡啟動(dòng)，最終導(dǎo)致雞顆粒細(xì)胞凋亡[4]。

線粒體是為細(xì)胞生存提供能量的動(dòng)態(tài)細(xì)胞器。線粒體的融合和分裂在正常情況下保持動(dòng)態(tài)平衡[5]。Drp1和Mfn2作為線粒體融合和分裂必需蛋白質(zhì)，已有研究表明，Drp1下調(diào)或Mfn2上調(diào)均會(huì)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)化膜的開放，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，甚至細(xì)胞壞死及凋亡[6]。線粒體為細(xì)胞正常功能運(yùn)轉(zhuǎn)提供能量供應(yīng)，其功能下降直接導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞功能降低，進(jìn)而降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，引起卵巢儲(chǔ)備功能減退[7]。研究表明mtDNA突變、缺失或功能障礙可對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎發(fā)育過程造成不良影響[8-9]。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因組tRNA-Lys7 719位點(diǎn)存在T→G變異(T7719G)，該變異與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)[10]，顆粒細(xì)胞與卵泡關(guān)系密切，且對(duì)于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，tRNA-Lys(T7719G)變異是否影響顆粒細(xì)胞生理功能未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以該基因變異對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞生理功能的影響開展研究，為線粒體基因變異與顆粒細(xì)胞功能相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

綿羊卵巢材料來(lái)源于河北省保定市唐縣屠宰場(chǎng)。屠宰后取卵巢組織用溫生理鹽水沖洗后，置于含有1%雙抗和37 ℃生理鹽水的保溫壺中，在4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與耗材

組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Annexin V-FITC雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix，北京博邁德基因技術(shù)有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；線粒體分離試劑盒，AngleGene公司；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

參考NCBI中GenBank綿羊線粒體基因組序列(AF010406.1)，利用Primer Premier 6設(shè)計(jì)覆蓋綿羊線粒體tRNA-Lys序列引物，該引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。上游引物序列為：5′-CTACGGTCAATGCTCAGAA-3′ ；下游引物序列為：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′。引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為290 bp。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢組織提取DNA

按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260 nm、280 nm處的OD值，計(jì)算DNA含量和OD260/OD280的比值，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR測(cè)序鑒定基因型

以綿羊卵巢組織為模板DNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳電壓設(shè)為100 V，電流100 mA，時(shí)間30 min，觀察膠帶亮度及長(zhǎng)度。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分析鑒定基因型。測(cè)序結(jié)果通過DNAMAN軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，運(yùn)用Oligo 7 Primer Analysis Software將試驗(yàn)綿羊序列與綿羊線粒體基因組標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank：AF010406.1)比對(duì)分析。

1.2.3 顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

選取G、T基因型母羊，采集雙側(cè)卵巢并使用生理鹽水、75%酒精清洗，放于含有1% 雙抗和37 ℃生理鹽水的保溫壺中，在4 h內(nèi)送至試驗(yàn)室。取出卵巢，用生理鹽水清洗數(shù)次直至液體清澈，洗凈后剪去系膜，75%酒精沖洗1次，再放入盛有生理鹽水的燒杯中，反復(fù)清洗3次；用鑷子夾取刀片，在細(xì)胞培養(yǎng)基中把卵巢的適當(dāng)大小卵泡進(jìn)行切割；將上述液體全部移入15 mL無(wú)菌離心管中，離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為2 000 r/min，定時(shí)離心5 min，棄上清液，加入2 mL PBS吹打懸浮，2 000 r/min 定時(shí)離心5 min，棄上清液，重復(fù)2～3次，加入10%胎牛血清、1% 雙抗和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打懸浮細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況。

1.2.4 顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin V-FITC雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 顆粒細(xì)胞分裂和融合相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

使用線粒體分離試劑盒進(jìn)行線粒體分離，參考BCA蛋白定量試劑盒中的說明書，對(duì)所制取的蛋白進(jìn)行定量測(cè)量。使用參考文獻(xiàn)[11]中的Western blot方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2和分裂相關(guān)蛋白Drp1、MFF的表達(dá)水平。其中一抗、二抗雜交稀釋信息如表1、2所示。采用BandScan 5.0軟件分析。

表1 融合分裂相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)一抗信息

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序表明線粒體tRNA-Lys基因編碼區(qū)7 719位點(diǎn)存在T→G變異(圖1)。

圖1 tRNA-Lys基因變異位點(diǎn)測(cè)序峰圖

2.2 卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

將相同處理后的不同基因型的顆粒細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)后，檢測(cè)凋亡情況，結(jié)果表明：G基因型凋亡率和T基因型凋亡率相比顯著降低(P<0.05)，G基因型細(xì)胞凋亡率為T基因型的60%(圖2)?？梢娋€粒體tRNA-Lys(T7719G)變異對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞具有明顯抑制凋亡的作用。

A.不同基因型使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B. 不同基因型顆粒細(xì)胞總凋亡率。*表示P<0.05，下同。

2.3 線粒體融合分裂相關(guān)蛋白表達(dá)量

鑒定綿羊基因型，提取不同基因型顆粒細(xì)胞總蛋白，用Western blot方法檢測(cè)融合分裂相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明(圖3)，不同基因型顆粒細(xì)胞Drp1、Mfn1、Mfn2相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)，G基因型細(xì)胞MFF蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

A. 聚丙烯酰胺凝膠電泳；B. 定量分析。

3 討論

細(xì)胞凋亡是經(jīng)過嚴(yán)格調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡方式，其過程涉及一系列生化反應(yīng)。線粒體凋亡途徑被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的主要模式，在細(xì)胞發(fā)育過程中扮演著重要的角色。在各種凋亡信號(hào)的刺激下，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來(lái)形成凋亡體復(fù)合物。隨后激活caspase家族中介導(dǎo)凋亡的caspase-9，活化的caspase-9進(jìn)一步切割并激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)線粒體的凋亡[12]。線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致ROS增加，形成惡性循環(huán)。高水平的ROS可以損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，線粒體的功能維持對(duì)于細(xì)胞生存至關(guān)重要。顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育和成熟過程中扮演著重要角色，其在調(diào)節(jié)和選擇原始卵泡池中的卵子與維持正常的卵泡閉鎖機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]。在卵泡發(fā)育的過程中，顆粒細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸增加，并對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)顆粒細(xì)胞受到外界或內(nèi)部信號(hào)的刺激，或者受到自身功能異常的影響時(shí)，會(huì)發(fā)生凋亡現(xiàn)象，從而對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致卵泡閉鎖。因此，顆粒細(xì)胞凋亡不僅是卵泡發(fā)育和成熟過程中的正常調(diào)節(jié)機(jī)制，也可能是卵泡閉鎖的重要原因之一[14]。本試驗(yàn)研究比較了不同基因型顆粒細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明G基因型變異對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞有明顯抑制凋亡作用，線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因變異可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。

線粒體不斷進(jìn)行分裂和融合，在分裂和分化過程中，環(huán)境變化的適應(yīng)程度對(duì)細(xì)胞的生存及生長(zhǎng)非常重要。當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，會(huì)通過一系列蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、組合，進(jìn)而形成自噬體，此后與溶酶體進(jìn)行結(jié)合，最終移除受損線粒體[15]。線粒體形態(tài)學(xué)的變化是線粒體功能損傷的表現(xiàn)，并與多種疾病相關(guān)[16]。Drp1參與兩種功能和機(jī)械上完全不同的裂變，一種是外周分裂，使受損的物質(zhì)脫落成更小的線粒體，從而進(jìn)行線粒體的自噬，當(dāng)線粒體自噬機(jī)制產(chǎn)生障礙，將導(dǎo)致線粒體系統(tǒng)性功能下降或線粒體數(shù)量冗余，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響并導(dǎo)致生物體發(fā)生相關(guān)疾?。涣硪环N是中間區(qū)分裂，導(dǎo)致線粒體增殖[17]。位于線粒體內(nèi)膜的MFF作為Drp1的受體，控制中間區(qū)分裂，在分裂過程中將Drp1聚集到線粒體，從而影響線粒體分裂[18]。對(duì)MFF下游蛋白Drp1的檢測(cè)結(jié)果顯示，不同基因型樣本間差異不顯著，可能是因?yàn)镈rp1不存在實(shí)質(zhì)性蛋白表達(dá)的增加。

人們對(duì)自噬進(jìn)行大量研究，并將其視為非選擇性降解蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的重要細(xì)胞途徑之一。除非選擇性的自噬細(xì)胞途徑之外，選擇性的自噬活動(dòng)在清除特定的細(xì)胞器方面也發(fā)揮了十分重要的作用，如細(xì)胞線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、核糖體自噬、溶酶體自噬等[19]。線粒體自噬的發(fā)生，是對(duì)線粒體功能障礙或損傷進(jìn)行高度保守降解與清除的過程，同樣是線粒體應(yīng)激反應(yīng)與穩(wěn)態(tài)調(diào)控的一個(gè)重要機(jī)制[20]。當(dāng)線粒體自噬機(jī)制受阻，可導(dǎo)致線粒體功能降低或線粒體冗余從而影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引起相關(guān)疾病[21-22]。目前認(rèn)為線粒體的融合和分裂在線粒體自噬過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究指出MFF的激活與線粒體分裂密切相關(guān)，是其重要調(diào)節(jié)機(jī)制[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)融合相關(guān)蛋白Mfn1和Mfn2表達(dá)量在G、T基因型樣本間無(wú)顯著差異，而分裂因子MFF蛋白量在G基因型樣本中顯著增高，MFF蛋白量的降低可能是由基因自身蛋白表達(dá)缺陷造成的，也可能是因?yàn)門基因型變異導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜損傷，MFF代謝發(fā)生異常。肖敏[24]研究發(fā)現(xiàn)MFF的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致線粒體裂變?cè)黾?，分裂加劇可以產(chǎn)生細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖所必需的細(xì)胞器，同時(shí)通過線粒體自噬促進(jìn)受損線粒體的消除。然而，如果線粒體自噬機(jī)制受阻，線粒體的功能會(huì)受到影響，可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)冠心病相關(guān)的線粒體tRNA-Thr變異(G15927A)會(huì)引起細(xì)胞線粒體自噬增加和分裂障礙，線粒體分裂因子MFF在變異的細(xì)胞中均有顯著降低[25]。

4 結(jié)論

線粒體tRNA-Lys(T7719G)變異對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞有明顯抑制凋亡作用，顯著提高分裂相關(guān)蛋白MFF表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞分裂。