陳雷剛 任慧敏 吳遠(yuǎn)慧 安國芝 景曉蕾 趙同心

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合過程中大量結(jié)締組織基質(zhì)過度沉積引起的皮膚疾病，其主要病理特征是局部組織中成纖維細(xì)胞過度增殖。瘢痕疙瘩有手術(shù)、局部藥物注射、冷凍治療和放射治療等治療方法，但臨床療效并不令人滿意，治療后的復(fù)發(fā)率較高。近些年，可見光聯(lián)合光敏劑的光動力療法在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的治療作用受到廣泛關(guān)注[1-2］。竹紅素A（hypocrellin A，HA）是一種從中草藥竹紅素中提取得到的光敏劑，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的抗癌作用[3-4］。紅光是波長600～700 nm 的可見光，通過光化學(xué)作用在瘢痕、皮炎、皮膚腫瘤等皮膚疾病中發(fā)揮治療價值[4-5］。有研究報道HA 能夠增強(qiáng)紅光在皮膚腫瘤[4］、瘢痕疙瘩[5］中的治療作用。Yes 相關(guān)蛋白（Yesassociated protein，YAP）是Hippo 信號通路的下游信號分子。研究報道，YAP 在瘢痕疙瘩形成過程中促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[6-7］，HA 的抗癌作用與抑制YAP 通路相關(guān)[8］。本研究通過細(xì)胞實驗對HA 聯(lián)合LED 紅光照射通過YAP 途徑抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts，KFs）增殖的生物學(xué)作用及機(jī)制展開探索，旨在深入認(rèn)識HA 聯(lián)合紅光在瘢痕疙瘩中的治療價值及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選擇6 例因瘢痕疙瘩在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受手術(shù)切除的患者，收集瘢痕疙瘩組織。其中男性1 例、女性5 例，年齡24～36 歲、平均（28.82±5.23）歲。本研究獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：W2023034），患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 HA 購自南通飛宇生物科技公司，陰性對照（negative control，NC）質(zhì)粒、YAP 質(zhì)粒購自武漢金開瑞生物科技公司，CCK8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒和BrdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒分別購自上海翌圣生物科技公司和武漢賽培生物科技公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的檢測試劑盒購自南京建成研究所，YAP、β-catenin 的一抗購自美國Abcam 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，LED 紅光光源購自中國科學(xué)院電子所北京科電微波電子公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 KFs的原代培養(yǎng) 用磷酸鹽緩沖液沖洗瘢痕疙瘩組織，去除表皮、保留真皮，在0.25% 胰蛋白酶中4℃消化10 h，磷酸鹽緩沖液漂洗組織、剪為1 mm3的組織塊并移入50 mL 離心管，加入30 倍量0.2% IV 型膠原酶并在37℃消化，直至組織成為絮狀，消化懸液在200 目篩網(wǎng)過濾，濾液1 000 r/min 離心10 min 后保留沉淀，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至每毫升2×106個。將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，每2天換液，待細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行消化傳代，收集第3代KFs 進(jìn)行分組處理。

1.3.2 KFs的分組及處理 第3 代KFs 接種在培養(yǎng)板中，按照下列方法進(jìn)行分組處理：①對照組：在不含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不進(jìn)行LED 紅光照射；②H 組：在含有1.0 μmol/L Hypocrellin A 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，持續(xù)4 h；③L 組：LED 紅光照射，輻射劑量3 J/cm2、輻射密度5.68 mW/cm2、距離20 mm、時間9 min；④H+L 組：先給予Hypocrellin A 處理、條件同H 組，而后給予LED 紅光照射、條件同L 組；⑤NC 質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)染NC 質(zhì)粒、質(zhì)粒終濃度為2.5 μg/mL；⑥NC 質(zhì)粒+H+L 組：轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒、質(zhì)粒終濃度為2.5 μg/mL，同時先給予Hypocrellin A 處理、而后給予LED 紅光照射；⑦YAP 質(zhì)粒+H+L組：轉(zhuǎn)染YAP 質(zhì)粒、質(zhì)粒終濃度為2.5 μg/mL，同時先給予Hypocrellin A 處理、而后給予LED 紅光照射。

1.3.3 細(xì)胞增殖的檢測 KFs 接種在96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)20 h 后分組處理，而后在每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 μL CCK8 檢測液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后在酶標(biāo)儀中檢測450 nm 波長的吸光度（OD）。

1.3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 KFs 接種在12 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)20 h 后分組處理，而后檢測細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px 的含量，檢測操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 蛋白表達(dá)水平的檢測 KFs 接種在12 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)20 h 后分組處理，而后提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果將30 μg 蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測，電泳后電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5% 脫脂牛奶封閉1 h，4℃孵育YAP 一抗（稀釋比例1∶1 000）、β-catenin 一抗（稀釋比例1∶500）或β-actin 一抗（稀釋比例1∶5 000）過夜。次日室溫孵育二抗（稀釋比例1∶1 000）1 h。最后在凝膠成像系統(tǒng)中對硝酸纖維素膜中的YAP、β-catenin 及β-actin 進(jìn)行顯影，以β-actin 的條帶灰度值為內(nèi)參、計算YAP、β-catenin 的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布計量資料以±s> 表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA 聯(lián)合LED 紅光照射對KFs 增殖的影響 H 組和L 組KFs 的OD450 水平低于對照組（t=7.032、5.711，P＜0.001）、BrdU 陽性率低于對照組（t=6.579、6.041，P＜0.001）；H+L 組KFs 的OD450 水平及BrdU陽性率低于H 組和L 組（t=11.473、10.280，P＜0.001）。見表1。

表1 4組KFs增殖水平的比較（±s)

表1 4組KFs增殖水平的比較（±s)

注：與對照組比較，①P＜0.05；與H組比較，②P＜0.05；與L組比較，③P＜0.05。

OD450水平1.03±0.11 0.65±0.05①0.71±0.06①0.34±0.04①②③96.919＜0.001組別對照組H組L組H+L組F值P值例數(shù)6 6 6 6 BrdU陽性率（%）77.84±6.23 54.95±4.66①56.51±4.85①29.49±3.32①②③98.816＜0.001

2.2 Hypocrellin A 聯(lián)合LED 紅光照射對KFs 氧化應(yīng)激的影響 H 組和L 組KFs 中MDA 的水平高于對照組，SOD、GSH-Px 的水平低于對照組（P＜0.05）；H+L 組KFs 中MDA 的水平高于H 組和L 組，SOD、GSH-Px 的水平低于H 組和L 組（P＜0.05）。見表2。

表2 4組KFs氧化應(yīng)激水平的比較（±s)

表2 4組KFs氧化應(yīng)激水平的比較（±s)

注：MDA為丙二醛；SOD為超氧化物歧化酶；GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶；與對照組比較，①P＜0.05；與H組比較，②P＜0.05：與L組比較，③P＜0.05。

GSH-Px（U/mg）0.89±0.07 0.64±0.05①0.61±0.06①0.39±0.04①②③79.794＜0.001組別對照組H組L組H+L組F值P值例數(shù)6 6 6 6 MDA（nmol/mg）0.73±0.08 1.15±0.11①1.22±0.10①1.59±0.12①②③69.534＜0.001 SOD（U/mg）0.38±0.03 0.25±0.02①0.28±0.02①0.16±0.01①②③109.667＜0.001

2.3 Hypocrellin A 聯(lián)合LED紅光照射對KFs中YAP途徑的影響 H 組和L 組KFs 中YAP 的表達(dá)水平低于對照組（t=8.705、10.446，P＜0.001）、β-catenin 的表達(dá)水平低于對照組（t=10.608、11.776，P＜0.001）；H+L 組KFs 中YAP 的表達(dá)水平低于H 組和L 組（t=16.432、12.598，P＜0.001）、β-catenin 的表達(dá)水平低于H 組和L 組（t=13.587、7.668，P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 4組KFs中YAP、β-catenin的表達(dá)

表3 4組KFs中YAP、β-catenin表達(dá)水平的比較（±s)

表3 4組KFs中YAP、β-catenin表達(dá)水平的比較（±s)

注：YAP為Yes相關(guān)蛋白；β-catenin為β-連環(huán)蛋白；與對照組比較，①P＜0.05；與H組比較，②P＜0.05；與L組比較，③P＜0.05。

β-catenin 0.83±0.08 0.46±0.03①0.40±0.04①0.26±0.02①②③152.667＜0.001組別對照組H組L組H+L組F值P值例數(shù)6 6 6 6 YAP 0.87±0.09 0.52±0.04①0.45±0.04①0.22±0.02①②③148.581＜0.001

2.4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對Hypocrellin A 聯(lián)合LED 紅光照射抑制KFs 中YAP 途徑的影響 NC 質(zhì)粒+H+L 組KFs 中YAP、β-catenin 的表達(dá)水平低于NC 質(zhì)粒（t=13.919、17.557，P＜0.001）；YAP 質(zhì)粒+H+L 組KFs 中YAP、β-catenin 的表達(dá)水平高于NC 質(zhì)粒+H+L 組（t=12.736、13.942，P＜0.001）。見圖2、表4。

圖2 3組KFs中YAP、β-catenin表達(dá)水平的比較

表4 3組KFs中YAP、β-catenin表達(dá)水平的比較（±s)

表4 3組KFs中YAP、β-catenin表達(dá)水平的比較（±s)

注：YAP為Yes相關(guān)蛋白；β-catenin為β-連環(huán)蛋白；與NC質(zhì)粒組比較，①P＜0.05；與NC質(zhì)粒+H+L組比較，②P＜0.05。

例數(shù)6 6 6 β-catenin 0.97±0.09 0.29±0.03①0.83±0.09②135.719＜0.001組別NC質(zhì)粒組NC質(zhì)粒+H+L組YAP質(zhì)粒+H+L組F值P值YAP 0.93±0.10 0.35±0.04①0.91±0.10②90.333＜0.001

2.5 上調(diào)YAP 對Hypocrellin A 聯(lián)合LED 紅光照射抑制KFs 增殖的影響 NC 質(zhì)粒+H+L 組KFs 的OD450水平及BrdU 陽性率低于NC 質(zhì)粒組（t=15.682、14.057，P＜0.001）；YAP 質(zhì)粒+H+L 組KFs 的OD450水平及BrdU 陽性率高于NC 質(zhì)粒+H+L 組（t=13.430、10.991，P＜0.001）。見表5。

表5 3組KFs增殖水平的比（±s)

表5 3組KFs增殖水平的比（±s)

注：與NC質(zhì)粒組比較，①P＜0.05；與NC質(zhì)粒+H+L組比較，②P＜0.05。

BrdU陽性率（%）74.59±6.69 28.59±4.41①63.93±6.53②97.671＜0.001組別NC質(zhì)粒組NC質(zhì)粒+H+L組YAP質(zhì)粒+H+L組F值P值例數(shù)6 6 6 OD450水平1.06±0.10 0.37±0.04①0.91±0.09②120.335＜0.001

2.6 上調(diào)YAP 對Hypocrellin A 聯(lián)合LED 紅光照射抑制KFs 氧化應(yīng)激的影響 NC 質(zhì)粒+H+L 組KFs 中MDA 的水平高于NC 質(zhì)粒組，SOD、GSH-Px 的水平低于NC 質(zhì)粒組（P＜0.05）；YAP 質(zhì)粒+H+L 組KFs 中MDA 的水平低于NC 質(zhì)粒+H+L 組，SOD、GSH-Px 的水平高于NC 質(zhì)粒+H+L 組（P＜0.05）。見表6。

表6 3組KFs氧化應(yīng)激水平的比較（±s)

表6 3組KFs氧化應(yīng)激水平的比較（±s)

注：MDA為丙二醛；SOD為超氧化物歧化酶；GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶；與NC質(zhì)粒組比較，①P＜0.05；與NC質(zhì)粒+H+L組比較，②P＜0.05。

GSH-Px 0.81±0.08 0.44±0.05①0.68±0.06②50.736＜0.001組別NC質(zhì)粒組NC質(zhì)粒+H+L組YAP質(zhì)粒+H+L組F值P值例數(shù)6 6 6 MDA 0.81±0.09 1.67±0.14①1.03±0.11②90.271＜0.001 SOD 0.45±0.04 0.19±0.02①0.34±0.03②105.724＜0.001

3 討論

紅光聯(lián)合光敏劑的光動力療法是治療瘢痕疙瘩、痤瘡、部分皮膚腫瘤、尖銳濕疣等皮膚疾病的常用方法[9-11］。HA 是從真菌竹紅菌中提取得到的光敏劑。有研究報道，HA 聯(lián)合紅光對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較單用HA 或紅光增強(qiáng)[4］。KFs 過度增殖是瘢痕疙瘩形成過程中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[12-13］。相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究證實，光動力療法聯(lián)合氨基酮戊酸對KFs 的增殖及膠原的合成具有抑制作用[14-15］。但目前瘢痕疙瘩的臨床治療效果并不令人滿意，治療后的復(fù)發(fā)率較高。本研究聯(lián)合使用光敏劑HA 與紅光進(jìn)行KFs 處理，旨在初步揭示HA 聯(lián)合紅光在瘢痕疙瘩中的治療價值，通過CCK8 法和Brd 法檢測增殖可知：HA 和紅光單獨或聯(lián)合處理均抑制KFs 的增殖，HA 對KFs 增殖的作用與其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)一致，紅光對KFs 增殖的抑制作用與其他學(xué)者報道光動力療法抑制KFs 增殖的結(jié)果吻合[14-15］。本研究中，HA 聯(lián)合紅光對KFs 增殖的抑制作用強(qiáng)于單獨處理，表明HA 和紅光聯(lián)用起到互相增強(qiáng)生物學(xué)效應(yīng)的作用。

紅光殺傷細(xì)胞的光化學(xué)作用與增加自由基生成、刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[16］。HA 作為光敏劑，吸收有效光后能夠促進(jìn)自由基生成并放大氧化應(yīng)激反應(yīng)、起到細(xì)胞殺傷作用[4］。細(xì)胞在自由基作用下發(fā)生氧化應(yīng)激損傷后，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 生成增多，同時不斷消耗抗氧化物SOD 和GSH-Px、表現(xiàn)為抗氧化物含量降低。本研究中，HA 和紅光單獨處理KFs 后細(xì)胞中MDA 含量增加，SOD 和GSH-Px 含量降低，表明HA 和紅光均具有激活KFs 氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，進(jìn)而提示兩種治療方式可能通過激活氧化應(yīng)激的方式抑制KFs增殖。本研究中，HA 聯(lián)合紅光對KFs 氧化應(yīng)激的激活作用強(qiáng)于單獨處理，這一結(jié)果與聯(lián)合處理抑制細(xì)胞增殖作用更強(qiáng)的結(jié)果吻合。

細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激受到復(fù)雜信號通路的調(diào)控，其中Hippo 通路在進(jìn)化上高度保守且作用廣泛。YAP是Hippo 通路下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前的多數(shù)研究均證實YAP 具有促增殖、抗凋亡、抗氧化的作用[17-18］。在成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中，過表達(dá)YAP 減輕細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)[19］；在惡性腫瘤細(xì)胞中，YAP 通過增加β-catenin 表達(dá)的方式促進(jìn)細(xì)胞增殖[20］。本研究中，HA 和紅光單獨及聯(lián)合處理KFs 后細(xì)胞中YAP和β-catenin 的表達(dá)均降低，并且聯(lián)合處理后YAP 和β-catenin 表達(dá)降低的效應(yīng)更顯著，提示兩種治療方式均抑制YAP/β-catenin 途徑且聯(lián)合處理的抑制效應(yīng)更強(qiáng)。為進(jìn)一步闡明YAP 途徑在HA 聯(lián)合紅光抑制KFs 增殖中的作用，本研究設(shè)計了轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)實驗，HA聯(lián)合紅光處理的同時轉(zhuǎn)染YAP 表達(dá)質(zhì)粒增加YAP 的表達(dá)后，細(xì)胞增殖減弱、氧化應(yīng)激增強(qiáng)的作用被逆轉(zhuǎn)，表明HA 聯(lián)合紅光通過抑制YAP 途徑抑制KFs 增殖、刺激KFs 氧化應(yīng)激。

綜上所述，HA 和LED 紅光照射均顯著抑制KFs增殖、激活KFs 氧化應(yīng)激，兩者聯(lián)合抑制增殖、激活氧化應(yīng)激的作用強(qiáng)于單一處理，抑制YAP/β-catenin 途徑是HA 聯(lián)合LED 紅光照射抑制KFs 增殖、激活KFs 氧化應(yīng)激的相關(guān)分子機(jī)制之一。