王 婷，張 黎，儲(chǔ)永雙，王迎秋，任艷鑫，黃 寧*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650000； 2.昆明市第三人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，云南 昆明 65000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院頭頸外一科，云南 昆明 650000）

鼻咽癌為鼻咽上皮腫瘤［1-2］，2015 年我國(guó)有6 萬(wàn)例，其中3.4 萬(wàn)例死亡［3］，其治療以放療為主［4］，但初步治療5% ～20%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)［5-6］； 到晚期以放化療聯(lián)合為主，可改善患者的生存情況，但引起的不良反應(yīng)使其生存質(zhì)量下降［7］，故需開(kāi)發(fā)抗腫瘤同時(shí)提高生存質(zhì)量的藥物。

植物活性成分具有益處多和副作用小一直被用作藥物有效替代［8］。研究表明，雷公藤紅素通過(guò)抑制自噬和NFκB 的異常激活作用骨關(guān)節(jié)炎［9］，對(duì)MSCLC 的影響是因蛋白酶體活性的抑制［10］，降低microRNA-21 抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移［11］，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡通過(guò)ERK1/2 和p38 MAPK［12］，通過(guò)死亡受體和線粒體途徑激活誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡［13］。雷公藤紅素作用靶點(diǎn)多，機(jī)制復(fù)雜，故需進(jìn)一步研究以確定它與鼻咽癌之間其他相互作用的靶點(diǎn)，闡明其機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物靶點(diǎn)與特定節(jié)點(diǎn)或模塊間的交互作用結(jié)合起來(lái)的一種藥理學(xué)方法，來(lái)闡明藥物和靶點(diǎn)之間的聯(lián)系［14］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接驗(yàn)證雷公藤紅素的作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌機(jī)制影響，再通過(guò)CNE-1 細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)雷公藤紅素藥理作用，以期為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1 （低分化） 購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物 雷公藤紅素購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司，編號(hào)DL0035。

1.3 試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)B1106022）、胎牛血清（批號(hào)BS1612-109）（美國(guó)Bioexplorer 公司）； 青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)BL505A）、PBS 緩沖液（批號(hào)1401130）（合肥蘭杰柯科技有限公司）； AnnexinV 633Apoptosis Detection Kit（日本同仁化學(xué)公司，批號(hào)0600452）； DMSO （美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)506008）； 兔抗IKBKB、NF-κB P65、Phospho-NF-κB P65、抗兔二抗（美國(guó)Affinity 公司，批號(hào)DF6811、AF5006、AF2006、AF7018）。電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽（北京普天新橋技術(shù)有限公司）； BD FACSCelesta3激光流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences 公司）。

2 方法

2.1 鼻咽癌靶點(diǎn)篩選 通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 搜索關(guān)鍵詞 “celastrol”，得到其3D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swisstarget 平臺(tái) （http： //www.swisstar-getprediction.ch/），得到相關(guān)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。再通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www.genecards.org/） 搜索關(guān)鍵詞“鼻咽癌”，得到其相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)微生信云平臺(tái)（http： //www.bioinformatics.com.cn/） 繪制鼻咽癌與Celastrol 的靶點(diǎn)交集圖。

2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建及分析 將微生信云平臺(tái)得到韋恩圖中的雷公藤紅素-鼻咽癌交集基因輸入至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //string-db.org/），獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

2.3 靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析 在Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //metascape.org/） 中輸入交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 通路富集分析，得到相關(guān)靶點(diǎn)功能和通路。

2.4 “雷公藤紅素-靶點(diǎn)-鼻咽癌-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 收集雷公藤紅素抗鼻咽癌的交集靶點(diǎn)和KEGG 通路富集分析結(jié)果，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“雷公藤紅素-靶點(diǎn)-鼻咽癌-通路” 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，獲得度值前五的基因。

2.5 分子對(duì)接 采用Discovery studio 分子對(duì)接軟件建立藥物分子與靶點(diǎn)的相關(guān)性。通過(guò)RCSB： PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)得到對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Discovery Studio 中，初步預(yù)處理后通過(guò)加氫除水和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化優(yōu)化結(jié)構(gòu)，同時(shí)將雷公藤紅素分子式和陽(yáng)性藥物5-氟尿嘧啶分子式從PunChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載，再導(dǎo)入軟件構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)，對(duì)接后獲得LibDockScore，生成配體-蛋白相互作用3D 和2D 平面圖。

2.6 MTT 法檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)CNE-1 細(xì)胞的增殖抑制作用 消化離心收集細(xì)胞，以每孔2.0×105的密度接種于96孔板上，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2 天加入含雷公藤紅素的培養(yǎng)基100 μL，濃度分別為0、2、4、6 μmol/L，培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入25 μL MTT，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光慢搖10 min，在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的促凋亡作用 按“2.6” 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，用無(wú)EDTA 的0.25%胰蛋白酶溶液洗滌，收集細(xì)胞，加入染色液，避光常溫染色15 min，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.8 Western blot 法檢測(cè)IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達(dá) 將CNE-1 細(xì)胞密度調(diào)整為5.0×105/mL，接種于6 孔板中，每孔1.5 mL，培養(yǎng)過(guò)夜，分別加入0、4 μmol/L 雷公藤紅素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS 清洗3 次，裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，檢測(cè)總蛋白濃度，變性，-80 ℃保存。SDS-PAGE 電泳80 V，30 min； 120 V，60 min； 100 V，150 min，封閉液37 ℃，30 min，TBST 洗膜3 次，加入一抗，室溫孵育30 min，4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST 清洗3 次，室溫二抗孵育2 h，TBST 洗膜3 次，條帶短暫保存在4 ℃新鮮TBST 中。采用ChemiDocTMMP 全能型成像系統(tǒng)顯影，以β-actin 為內(nèi)參，Image J 軟件計(jì)算蛋白表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.1.1 雷公藤紅素潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 3D 結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，將其導(dǎo)入SwissTarget 平臺(tái)中獲得雷公藤紅素靶點(diǎn)，通過(guò)Probability排序，獲得前10 個(gè)基因名稱和靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 雷公藤紅素排名前十的潛在作用靶點(diǎn)

圖1 雷公藤紅素3D 結(jié)構(gòu)

3.1.2 雷公藤紅素與鼻咽癌相關(guān)的共同靶點(diǎn) 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與鼻咽癌相關(guān)的基因靶點(diǎn)2 143個(gè)，將101 個(gè)藥物靶點(diǎn)基因與其篩選出共同交集靶點(diǎn)基因38個(gè)，即為雷公藤紅素抗鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖2。

圖2 雷公藤紅素抗鼻咽癌潛在靶點(diǎn)

3.1.3 雷公藤紅素與鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò) 將38個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

圖3 雷公藤紅素抗鼻咽癌PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.4 GO 富集分析 得到生物過(guò)程（biological process，BP） 442 條、細(xì)胞組成（cellular component，CC） 18 條、分子功能（molecular function，MF） 35 條，將排名前十的三者利用微生信在線平臺(tái)繪制成氣泡圖，見(jiàn)圖4。由此可知，BP 主要包括細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)激素的反應(yīng)、防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、血管發(fā)育的調(diào)節(jié)等通路，CC 主要包括粘著斑、細(xì)胞-基質(zhì)連接、受體復(fù)合物、膜筏、膜微區(qū)細(xì)胞組成部分等通路，MF 主要包括內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等途徑。

圖4 GO 功能富集分析

3.1.5 KEGG 通路富集分析 共得到77 條通路，根據(jù)P值排序，發(fā)現(xiàn)前15 條通路包括腫瘤、新冠肺炎、PI3KAkt、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、人T 細(xì)胞白血病病毒1 型感染等，氣泡圖見(jiàn)圖5。由此可知，在腫瘤、PI3K-Akt 等通路上富集較多。

圖5 KEGG 通路富集分析

3.1.6 “雷公藤紅素-靶點(diǎn)-鼻咽癌-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型 見(jiàn)圖6，左側(cè)38 個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表雷公藤紅素抗鼻咽癌交集的靶點(diǎn)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值按順時(shí)針從大到小依次排列； 右側(cè)15個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)則對(duì)應(yīng)了KEGG 富集結(jié)果中的15 條通路，連線顯示了通路和靶點(diǎn)之間的相互作用，度值前五的基因?yàn)镴AK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2。

圖6 “雷公藤紅素-靶點(diǎn)-鼻咽癌-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.7 分子對(duì)接 將“3.1.6” 項(xiàng)下排名前五的基因與雷公藤紅素分別進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)，同時(shí)以5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，雷公藤紅素與IKBKB和JAK2 有較好結(jié)合活性，LibDockScore 越高，結(jié)合越穩(wěn)定。雷公藤紅素與IKBKB的 LibDockScore 為94.266 3，與JAK2 的LibDockScore 為67.294 6，而5-氟尿嘧啶與IKBKB的LibDockScore 為63.204 8。以3D 作用圖和2D 相互作用圖進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)圖7，可知雷公藤紅素中的羥基與IKBKB中的CYS99 形成氫鍵，雷公藤紅素中的羰基與JAK2 中的HIS950 形成氫鍵，5-氟尿嘧啶中的嘧啶環(huán)3 號(hào)氮和6 號(hào)羥基分別與IKBKB 中的SER436 和ARG404 形成氫鍵。因雷公藤紅素與IKBKB的LibDockScore 值遠(yuǎn)大于雷公藤紅素與JAK2 的，故后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)圍繞IKBKB進(jìn)行。

圖7 “活性成分-作用靶點(diǎn)” 分子對(duì)接圖

3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3.2.1 雷公藤紅素對(duì)CNE1 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，雷公藤紅素各劑量組細(xì)胞存活率降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖8。

圖8 雷公藤紅素對(duì)CNE1 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）

3.2.2 雷公藤紅素對(duì)CNE1 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，雷公藤紅素各劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖9。

圖9 雷公藤紅素對(duì)CNE1 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝6）

3.2.3 雷公藤紅素對(duì) CNE-1 細(xì)胞 IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，雷公藤紅素4 μmol/L組細(xì)胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖10。

圖10 雷公藤紅素對(duì)CNE-1 細(xì)胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

鼻咽癌是一種鼻咽上皮里的惡性腫瘤。根據(jù)鼻咽癌發(fā)生的范圍和位置，患者可能會(huì)出現(xiàn)鼻塞、鼻出血、伴有聽(tīng)力損傷的中耳炎、頸部腫塊或其他神經(jīng)癥狀，比如頭痛和面部麻木［15］。鼻咽癌患者在放療時(shí)會(huì)誘發(fā)口干癥［16］。還會(huì)導(dǎo)致口腔潰瘍發(fā)炎、嘴唇活動(dòng)受阻、飲食困難、甚至腦脊髓并發(fā)癥等一系列不良反應(yīng)［17］。

中醫(yī)藥目前已獲得廣泛的抗腫瘤臨床應(yīng)用，在延長(zhǎng)患者的生命、提高其生活質(zhì)量等方面的作用得到了更多的肯定［18］。Chan 等［19］研究表明，雷公藤紅素通過(guò)抑制CXCR4相關(guān)信號(hào)和抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)對(duì)肝細(xì)胞癌的潛在抗癌作用。Lin 等［20］研究表明，雷公藤紅素促進(jìn)口腔癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是誘導(dǎo)JNK1/2 信號(hào)通路。

本研究分析了雷公藤紅素“藥物-靶點(diǎn)-疾病-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)果顯示JAK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2 等度值較高，是雷公藤紅素治療鼻咽癌的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)基因。再結(jié)合分子對(duì)接分析，結(jié)果顯示雷公藤紅素與IKBKB和JAK2 有較好結(jié)合活性，故推測(cè)IKBKB為雷公藤紅素作用于鼻咽癌的主要靶點(diǎn)基因。IKBKB （又名為IKKβ） 是IKK 復(fù)合體中一個(gè)重要的催化亞基，IKBKB 與催化亞基IKKα 以及調(diào)節(jié)亞基IKKγ 結(jié)合而形成IKK 復(fù)合物。在組成IKK 復(fù)合物的催化亞基中，NF-κB 的激活I(lǐng)KBKB 起到不可或缺的作用［21］。故NF-κB 信號(hào)通路是雷公藤紅素作用于鼻咽癌的關(guān)鍵通路。李媛媛等［22］研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌細(xì)胞中敲除IKKβ 可以降低NF-κB 引起的炎癥反應(yīng)。Zhou 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，miR-429 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。miR-429 可與IKKβmRNA 的3′-UTR 結(jié)合，過(guò)度表達(dá)IKKβ 可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖，阻斷miR-429 的作用，說(shuō)明miR-429 作為腫瘤抑制因子的機(jī)制為與IKKβ 相互作用，IKKβ 是激活NF-κB 核轉(zhuǎn)運(yùn)的IKK 復(fù)合物的催化亞單位。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接進(jìn)行預(yù)測(cè)，而后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子實(shí)驗(yàn)等對(duì)雷公藤紅素抗鼻咽癌的機(jī)制進(jìn)行了多維度深層次的研究，為未來(lái)鼻咽癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)及臨床治療提供了重要的參考依據(jù)。