徐夢(mèng)潔，肖 姣，張曉瑩，剛芳莉，楊欣超，顏廷旭*

（1.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000； 2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)無(wú)涯創(chuàng)新學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

全球范圍內(nèi)約有5 000 萬(wàn)老年人患有癡呆癥，阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） 是最常見的類型［1-2］。目前AD 藥物的主要作用集中于延緩發(fā)病進(jìn)程，無(wú)法改善或治愈AD［3-4］。中藥由于其多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)，成為了抗AD 藥物研究的焦點(diǎn)［5-7］。

萱草花為百合科萱草屬植物黃花萱草Hemerocallis citrinaBaroni 的花蕾部分，為藥食兩用資源［8］。現(xiàn)代藥理研究表明，萱草花具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用，可改善抑郁并發(fā)的記憶力損傷，但其抗AD 作用機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)報(bào)道［9-10］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)，從整體研究探討藥物和疾病的相關(guān)性，為藥物研究提供理論基礎(chǔ)的分析方法［11-13］。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探究萱草花抗AD 的潛在作用及機(jī)制，為相關(guān)藥物的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 50 只10 月齡SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京斯貝福生物科技股份有限公司［質(zhì)量合格證編號(hào)110324231100154563，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0010］，飼養(yǎng)于康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （冀） 2021-006］，環(huán)境溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度45% ～55%，12 h/12 h 光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物研究經(jīng)康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司動(dòng)物倫理會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)MDL-2023-01-11-2）

1.2 試劑與藥物 萱草花由念之安生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)B20211019，總黃酮含量12 mg/g，70% 乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h）。脂多糖（LPS，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GC205009）； 多奈哌齊（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S70192）； 重組beta Amyloid1-42（Aβ1-42） 抗體 ［艾博抗 （上海） 貿(mào)易有限公司，批號(hào)ab201060］； 膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）、白介素1β （interlenkin 1β，IL-1β） 抗體（美國(guó)CST 公司，批號(hào)80788、12242）； HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)SA00001-2）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 萱草花活性成分、靶點(diǎn)篩選 以 “Hemerocallis citrinaBaroni” 為關(guān)鍵詞，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)搜索萱草花化學(xué)成分，通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 獲得結(jié)構(gòu)，利用SwissADME （http： //www.swissadme.ch/index.php ）、TCMSP （ https： //tcmsp-e.com/tcmsp.php） 進(jìn)行篩選，并建立數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)Swiss Target Prediction 預(yù)測(cè)活性成分作用靶點(diǎn)，利用UniProt（https： //www.uniprot.org/） 校正名稱，合并各活性成分靶點(diǎn)后刪除重復(fù)數(shù)據(jù)。

2.1.2 AD 靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取 通過(guò)OMIM （https： //omim.org/）、GeneCards （https： //www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選“Alzheimer disease” 靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制AD 與萱草花的交集靶點(diǎn)。

2.1.3 “活性成分-AD” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件可視化“萱草花活性成分-AD” 網(wǎng)絡(luò)，連接的節(jié)點(diǎn)越密集，受該成分調(diào)控的靶點(diǎn)越多，即該成分是萱草花抗AD的重要活性成分。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //cn.stringdb.org） 進(jìn)行分析，模式設(shè)置為多種蛋白，物種限定為“Homosapiens”。

2.1.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 利用R3.6.0 軟件進(jìn)行GO 功能富集分析，從靶細(xì)胞的分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞成分（cellular component，CC） 和生物過(guò)程（biological process，BP） 確定基因富集的功能，P值與富集程度呈正相關(guān)，選取篩選校正后P＜0.05 的結(jié)果，繪制相應(yīng)氣泡圖。利用KEGG 途徑富集分析獲得樞紐靶點(diǎn)作用的途徑，將結(jié)果繪制成相應(yīng)氣泡圖。

2.1.6 分子對(duì)接 利用分子對(duì)接模擬軟件對(duì)7 種活性成分與篩選得到的核心靶點(diǎn)與PI3KR1 蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，將結(jié)果利用Plymol 軟件進(jìn)行可視化處理。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型制備 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組和萱草花低、高劑量組（400、800 mg/kg，質(zhì)量濃度分別為40、80 mg/mL），每組10 只。將萱草花溶于CMCNa 中，其中給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，對(duì)照組灌胃給予等體積CMC-Na 溶液。

2.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶力 采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄6 min 內(nèi)小鼠對(duì)迷宮臂的探索情況，若連續(xù)3 次進(jìn)入3 個(gè)臂則認(rèn)為完成1 次正確交替反應(yīng)，自發(fā)交替率＝ ［正確交替反應(yīng)次數(shù)/（總進(jìn)臂次數(shù)-2）］ ×100%。

2.2.3 HE 染色觀察腦組織病理變化 每組取3 只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流，取出完整腦組織，浸泡在磷酸鹽緩沖液中48 h，脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），用蘇木精和伊紅染色，在顯微鏡下觀察病理變化。

2.2.4 免疫組化檢測(cè)腦組織Aβ、IL-1β、GFAP 表達(dá) 取小鼠腦組織切片，放入60 ℃恒溫烘箱中2 h，脫蠟，經(jīng)抗原修復(fù)、封閉后加一抗Aβ、IL-1β、GFAP 孵育過(guò)夜，次日加二抗37 ℃孵育。使用AXIOCam 50 相機(jī)獲得顯微照片，Image Pro Plus 6.0 版軟件進(jìn)行分析。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.1.1 活性成分作用靶點(diǎn) 結(jié)合文獻(xiàn)及TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，得到活性成分7 種（表1），將其SMILES 導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共獲得457 個(gè)作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到149 個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 萱草花活性成分信息

3.1.2 活性成分靶點(diǎn)與AD 靶點(diǎn)交集分析 通過(guò)GENE Cards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到AD 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因共13 240 個(gè)，對(duì)兩者取交集后獲得交集靶點(diǎn)基因125 個(gè)，見圖1。

圖1 萱草花活性成分與AD 疾病共同靶標(biāo)韋恩圖

3.1.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶標(biāo)” 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中，黃色橢圓節(jié)點(diǎn)代表萱草花，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表萱草花中7種活性成分，紫色橢圓節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的線代表活性成分與作用靶點(diǎn)之間的相互作用，共包含133 個(gè)節(jié)點(diǎn)和352 個(gè)連接。

圖2 萱草花活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn)篩選 將125 個(gè)萱草花與AD 的交集靶點(diǎn)輸入 STRING，設(shè)置 minimum required interaction score 為0.7，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3，共獲得290 條連線。再通過(guò)CytoHubba 的MCC 對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，獲得排名前二十者，見圖4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.5 GO 及KEGG 富集分析 將125 個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)活性成分作用靶點(diǎn)富集在1 141個(gè)BP，主要包括細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、對(duì)刺激的反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控等； 98 個(gè)CC，主要包括膜結(jié)合細(xì)胞器、囊泡、膜結(jié)合細(xì)胞器等； 138 個(gè)MF，主要包括催化活性、蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、離子結(jié)合等，見圖5A。

圖5 GO 功能（A）、KEGG 通路（B） 富集分析

對(duì)萱草花與AD 的交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，篩選出10 條信號(hào)通路包括氮代謝、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等，見圖5B。

3.1.6 分子對(duì)接 將KEGG 通路位于PI3K/Akt 通路的核心蛋白（包括KDR、PIK3R1、PKT2、RAF1、VEGFA1） 與7 種活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定。結(jié)果，除香草酸以外其余6 種活性成分均與PIK3R1 蛋白表現(xiàn)出了良好的結(jié)合，見表2 和圖6。

圖6 分子對(duì)接圖

表2 核心活性成分與核心蛋白PIK3R1 的結(jié)合能

3.2 藥理實(shí)驗(yàn)

3.2.1 萱草花對(duì)AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響 如圖7A 所示，與空白組比較，模型組小鼠在Y 迷宮中的自發(fā)交替行為減少（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組自發(fā)交替率（P＜0.05）。如圖7B 所示，各組小鼠總進(jìn)臂次數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖7 萱草花對(duì)AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響（±s，n＝10）

3.2.2 萱草花對(duì)AD 小鼠腦組織病理學(xué)的影響 如圖8 所示，空白組小鼠海馬神經(jīng)元排列有序、緊密，核固縮現(xiàn)象較少； 模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列無(wú)序，核固縮神經(jīng)元數(shù)量增加； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組可改善LPS 誘導(dǎo)的核固縮現(xiàn)象。

圖8 萱草花對(duì)小鼠神經(jīng)元病理變化的影響

3.2.3 萱草花對(duì)小鼠腦組織Aβ 表達(dá)的影響 如圖9 所示，空白組小鼠海馬區(qū)可見少量Aβ 沉積； 與空白組比較，模型組小鼠海馬區(qū)Aβ 沉積水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組小鼠海馬區(qū)Aβ 沉積減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 萱草花對(duì)小鼠腦組織Aβ 表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.2.4 萱草花對(duì)小鼠腦組織IL-1β 表達(dá)的影響 如圖10 所示，與模型組比較，LPS 組小鼠海馬區(qū)IL-1β 表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花各劑量組小鼠海馬區(qū)IL-1β 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 萱草花對(duì)小鼠腦組織IL-1β 表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.2.5 萱草花對(duì)小鼠腦組織GFAP 表達(dá)的影響 如圖11 所示，與空白組比較，模型組小鼠海馬區(qū)GFAP 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花各劑量組小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況得到了一定的緩解，但GFAP 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖11 萱草花對(duì)小鼠腦組織GFAP 激活的影響（±s，n＝3）

3.2.6 萱草花對(duì)小鼠腦組織PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組小鼠腦組織p-Akt 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05），萱草花高劑量組小鼠腦組織PI3K 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖12。

圖12 萱草花對(duì)小鼠腦組織PI3K/Akt 通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

4 討論

中醫(yī)將AD 歸于“癡呆” “健忘” 范疇，認(rèn)為肝郁氣滯，內(nèi)生毒邪，上阻腦絡(luò)，易致癡呆［14］。萱草花可改善抑郁誘發(fā)的記憶力損傷，通過(guò)疏肝解郁、調(diào)暢氣機(jī)發(fā)揮治療“健忘” 的作用［15］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，萱草花的抗AD 活性可能與炎癥信號(hào)通路相關(guān)，這也與先前的研究報(bào)道相一致［16］。腹腔注射LPS 可以通過(guò)外周炎癥誘導(dǎo)腦部神經(jīng)炎癥的發(fā)生，整體破壞模型動(dòng)物的炎癥平衡體系而造成神經(jīng)損傷，是一種典型的AD 造模方法，結(jié)果表明，腹腔注射LPS 損傷了小鼠在Y 迷宮中的學(xué)習(xí)記憶力，同時(shí)IL-1β 水平的升高和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活也意味著神經(jīng)炎癥的發(fā)生［17-19］。AD 患者的臨床常用藥多奈哌齊作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，在改善AD 樣癥狀的同時(shí)可以干預(yù)AD 模型中炎癥的表達(dá)，但是其具體的抗炎作用機(jī)制尚未明了［20］。Aβ 是一種關(guān)鍵的AD 病理毒性蛋白，神經(jīng)炎癥的過(guò)度激活可以促進(jìn)Aβ 的生成，可能是加劇Aβ 毒性的重要途徑［21-23］。腹腔注射LPS后，小鼠海馬內(nèi)Aβ 的沉積水平升高，這是誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶力損傷的重要原因［24-25］； 高劑量組萱草花給藥后，小鼠的Aβ 沉積水平伴隨著記憶力的改善得到了回調(diào)，這表明萱草花確實(shí)具有潛在的抗AD 活性，與改善神經(jīng)炎癥相關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了萱草花抗AD的作用機(jī)制，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它可改善LPS 誘導(dǎo)的AD 模型鼠在Y 迷宮中的學(xué)習(xí)記憶力和病理?yè)p傷，抑制IL-1β 水平，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，為相關(guān)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。