曾格格，劉天琪，戴全武，黃振陽，何嘉偉，劉 毅

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D） 是臨床上最常見的胃腸道疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，F(xiàn)D 全球發(fā)病率約10% ～30%，我國約18% ～25%，且多發(fā)于女性［1-2］。FD 具體發(fā)病機制尚未明確，可能與胃腸運動障礙、內(nèi)臟高敏感性、“腦-腸肽” 分泌異常、心理疾病或感染幽門螺桿菌等有關(guān)［3］。中醫(yī)將FD 歸屬于“痞滿” “胃脘痛” 范疇，病位在胃，與脾、肝相關(guān)，以脾虛氣滯，胃失和降為基本病機，關(guān)鍵發(fā)病機制是脾胃虛弱［4］。黃芪建中湯最早記載于《金匱要略》，是中醫(yī)臨床用于建中補虛、益氣固本的代表方［5］。其中，黃芪為君藥，健脾益氣； 桂枝、生姜為臣藥，溫陽散寒； 飴糖補脾緩急； 白芍緩急止痛； 大棗、甘草補益脾氣，共為佐使藥［6］?，F(xiàn)黃芪建中湯已廣泛應(yīng)用于治療脾虛或以脾虛為主要證型的各類消化系統(tǒng)疾?。?-9］。目前對于黃芪建中湯治療FD 的研究多集中在療效觀察、臨床應(yīng)用，而對此方劑中各味中藥共同作用機制及網(wǎng)絡(luò)化協(xié)同作用尚不明確。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索黃芪建中湯干預(yù)脾胃虛寒型FD 的成分、靶點及信號通路，結(jié)合體內(nèi)實驗深入探究黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 的治療作用及作用機制，以期為黃芪建中湯臨床運用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級10 周齡昆明種雌性小鼠48 只，體質(zhì)量30～40 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼） 2020-0001］，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物房［實驗動物使用許可證號SYXK（鄂） 2017-0067］，室溫（25±3）℃，相對濕度40% ～55%，12 h/12 h 光照/黑暗交替，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進食、進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實驗符合實驗動物福利與倫理委員會要求（倫理號HLK-20221115-001）。

1.2 藥物 參考《方劑學(xué)》［10］，黃芪建中湯由黃芪5 g（批號220402）、桂枝9 g （批號210621）、白芍18 g （批號220903）、甘草6 g （批號220203）、生姜9 g （批號211209）、大棗12 g （批號220522）、飴糖30 g （批號220910） 組成，飲片均購于湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》 規(guī)定，每劑含89 g 生藥，常規(guī)煎煮濃縮至1 g/mL； 大黃（批號220614） 常規(guī)煎煮濃縮至1 g/mL。枸櫞酸莫沙必利分散片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號211112）。

1.3 試劑L-精氨酸（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號MB2140）； 碘乙酰胺（北京蘭杰柯科技有限公司，批號21167408）； 蔗糖（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20220505）。小鼠白細胞介素-6 （IL-6）、5-羥色胺（5-HT） ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號MU30044、MU30036）； 小鼠胃泌素（GAS） ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-ELM2669c）； 小鼠胃動素（MTL） 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，貨號MM-0211R2）； 蘇木素染液、伊紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司）； GAPDH 抗體、蛋白激酶B（Akt） 抗體、磷酸化蛋白酶B （p-Akt） 抗體、山羊抗鼠和抗兔IgG 二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號60004-1-1g、10176-2-AP、28731-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） 抗體、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K） 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A22996、AP0854）。

1.4 儀器 分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，型號ALC-210.2）； 全波長酶標(biāo)儀 （美國Thermo 公司，型號Multiskan FC）； 離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號TGL-16M）； 病理切片機（上海萊卡儀器有限公司，型號GT1001）； 正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；恒溫箱（武漢奧普斯試驗設(shè)備有限公司，型號LGF-070A）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5）； 脫色搖床（北京六一儀器有限公司，型號WD-9405A）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 黃芪建中湯與FD 潛在靶基因篩選 通過TCMSP 平臺查詢黃芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗活性成分，以口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18為條件，篩選出藥物有效成分及相應(yīng)靶點［11］，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化； HERB 本草組鑒獲取飴糖活性成分及其作用靶點； 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫，以“functional dyspepsia” 為檢索詞，檢索FD 的治療靶點。將藥物成分靶點和疾病靶點取交集，得到黃芪建中湯治療FD 的潛在作用靶點。

2.1.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)，運用Cytoscape 3.9.0 軟件中的Centiscape 插件進行拓撲分析，以網(wǎng)絡(luò)中所有點 （Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality） 的中位數(shù)平均值為標(biāo)準(zhǔn)，3 個拓撲參數(shù)值均大于中位數(shù)的靶點為核心靶點［12］。

2.1.3 GO、KEGG 通路富集分析 將潛在作用靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO、KEGG 通路富集分析，分別選取生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC） 中P值排名前10 位的條目及P值排名前20 位的KEGG 信號通路，利用微生信網(wǎng)站 （http： //www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化分析。

2.1.4 “藥物-成分-靶點-通路-疾病” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以黃芪建中湯、有效成分、潛在作用靶點、主要通路和FD 作為“節(jié)點”，節(jié)點間的相互作用作為“邊”，構(gòu)建“黃芪建中湯-有效成分-潛在作用靶點-主要通路-FD” 網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Cytoscape 3.9.0 軟件進行可視化。

2.1.5 分子對接 通過PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫尋找大分子結(jié)構(gòu)信息，PubChem 得到小分子3D 結(jié)構(gòu)，運用Auto Dock Tools及PyMOL 對裸蛋白進行去水、加氫、檢查電荷等前處理，Open Babel GUI 軟件轉(zhuǎn)換格式，利用Auto Dock Vina 分子對接，采用PyMOL 進行可視化處理。

2.2 動物實驗

2.2.1 模型建立 將48 只小鼠編號后稱定體質(zhì)量，隨機分為空白組、模型組、陽性組及高、中、低劑量組，每組8 只。依據(jù)文獻［13］ 報道采用綜合因素（碘乙酰胺＋饑飽失常＋游泳竭力＋L-精氨酸/冷大黃水煎液） 復(fù)制脾胃虛弱型FD 模型，持續(xù)8 d。

2.2.2 給藥及一般生存狀態(tài)觀察 造模結(jié)束后，根據(jù)人與動物體表面積系數(shù)換算［14］，高、中、低劑量組小鼠給藥劑量分別為15.38、7.67、3.84 g/kg 黃芪建中湯； 陽性組小鼠灌胃枸櫞酸莫沙必利分散片，給藥劑量為1.35 mg/kg；空白組與模型組每天灌胃給予等量體積生理鹽水，連續(xù)14 d。實驗過程中觀察各組小鼠一般生存狀況，并記錄體質(zhì)量、進食量、飲水量、毛發(fā)、游泳耐力等指標(biāo)。

2.2.3 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后小鼠禁食24 h，稱定體質(zhì)量并處死，頜下靜脈取血，離心，取血清，剪取胃、十二指腸組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理實驗； 其余十二指腸組織裝入無菌離心管中，液氨中冷凍，放入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。

2.2.4 胃排空率及小腸推進率檢測 給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水24 h，稱定體質(zhì)量后灌胃給予黑色半固體糊狀物0.4 mL/只（3 g 羧甲基纖維素鈉溶于80 mL 蒸餾水中，依次加入奶粉5 g、蔗糖4 g、淀粉4 g、活性炭末2 g，攪拌均勻，即得），20 min 后處死，迅速開腹，將幽門至回腸部剪下，測量幽門至炭末前沿和幽門至回腸部的距離，計算小腸推進率，公式為小腸推進率＝ ［L（以幽門為起點至黑色糊狀物推進距離） /S（小腸全長）］ ×100%。取出全胃，稱定質(zhì)量，沿胃大彎剪開，生理鹽水充分沖洗清潔后稱量胃凈重，計算胃排空率，公式為胃排空率＝ ［1- （胃總重-胃凈重） /所給糊重］ ×100%。

2.2.5 胃腸組織HE 染色病理學(xué)分析 取于4%多聚甲醛中固定24 h 以上的小鼠胃、十二指腸組織，修切、脫水、石蠟包埋、切片后蘇木素-伊紅染色，鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.2.6 ELISA 法檢測小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平 取各組小鼠血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平。

2.2.7 Western blot 法檢測十二指腸組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達 提取小鼠十二指腸組織總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA） 法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后孵育相應(yīng)一抗和二抗，暗室顯影，分析條帶灰度值，計算各目的蛋白相對表達。

2.2.8 免疫組化法檢測十二指腸組織EGFR 蛋白表達 小鼠十二指腸組織經(jīng)包埋、切片后，按試劑盒說明書進行免疫組化EGFR 染色，蘇木素染細胞核為藍色，表皮生長因子受體（EGFR） 表達的陽性結(jié)果為棕黃色。

2.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪建中湯與FD 潛在作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 篩選得到黃芪建中湯有效成分123 種，對應(yīng)2 165 個作用靶點，去重后得到308 個； FD 疾病靶點1 367 個。將藥物靶點與疾病靶點取交集后得到潛在作用靶點172 個。將其輸入STRING 數(shù)據(jù)庫生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.9.0 軟件進行拓撲分析，最后得到37 個核心靶點，見圖1，排名前15 位的關(guān)鍵核心靶點拓撲信息見表1。

表1 關(guān)鍵作用靶點相關(guān)拓撲參數(shù)

圖1 PPI 網(wǎng)絡(luò)中37 個核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 GO、KEGG 通路富集分析 GO 富集分析共416 條，其中BP 共187 條，主要富集在對基因表達的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)等； CC 共110 條，主要富集在細胞外空間、細胞外區(qū)域、大分子復(fù)雜等； MF 共119 條，主要富集在酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性等，選取GO 分析各排名前十的功能條目進行可視化。KEGG 通路富集分析共得到199 條相關(guān)通路（P＜0.01），主要富集在弓形體病、TNF 信號通路、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、IL-17 信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路，選取排名前20 條通路進行可視化。見圖2。

圖2 黃芪建中湯治療FD 靶點GO （A）、KEGG （B） 富集分析圖

3.3 黃芪建中湯治療FD 的“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò) 圖3 顯示，網(wǎng)絡(luò)中共涉及459 個節(jié)點和3 145 條邊，平均度值為13.70，平均相鄰節(jié)點數(shù)目為6.852，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.446，最短路徑為3.036，說明黃芪建中湯治療FD的過程是多成分、多靶點起效的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，與中藥作用的整體性、系統(tǒng)性和綜合性相吻合。

圖3 黃芪建中湯治療FD “藥物-成分-靶點-通路-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 分子對接 選擇排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素，與交互網(wǎng)絡(luò)中度值較高的關(guān)鍵核心靶點EGFR、Akt1、CASP3 和VEGFA 進行分子對接，結(jié)合能越小，分子之間親和力越好，＜-7 kcal/mol 表示親和活性良好，＜-9 kcal/mol 表示親和活性非常強［15］； 對接得分越低，配體與靶點之間結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)果見表2。再根據(jù)對接評分篩選最佳結(jié)合模式，進行可視化分析，結(jié)果見圖4。

表2 核心成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能

圖4 分子對接結(jié)果可視化分析圖

3.5 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃排空率及小腸推進率的影響 與空白組比較，模型組小鼠小腸推進率、胃排空率降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠小腸推進率、胃排空率升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃排空率、小腸推進率的影響（±s，n＝8）

3.6 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清GAS、IL-6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組和高、中劑量組小鼠血清GAS、IL-6 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平升高（P＜0.05，P＜0.05），而低劑量組小鼠血清GAS、IL-6 水平降低（P＜0.05），MTL 水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影響（±s，n＝8）

3.7 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃、十二指腸組織病理形態(tài)的影響 各組小鼠胃組織結(jié)構(gòu)清晰，胃黏膜整齊完整，未見明顯炎細胞、水腫、充血等病理改變?？瞻捉M小鼠十二指腸黏膜整齊完整，未見明顯炎性浸潤； 模型組小鼠十二指腸絨毛排列散亂，黏膜層出現(xiàn)腫脹、炎性浸潤現(xiàn)象； 與模型組比較，各給藥組十二指腸絨毛排列整齊程度有所改善，黏膜層炎性細胞浸潤出現(xiàn)不同程度改善，見圖7。

圖7 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃、十二指腸組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×100）

3.8 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與模型組比較，陽性組和高、中劑量組小鼠十二指腸組織p-Akt、p-PI3K 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

圖8 黃芪建中湯對各組小鼠十二指腸組織PI3K/Akt 通路蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.9 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織EGFR 蛋白表達的影響 空白組幾乎不見EGFR 的陽性表達； 與模型組比較，各給藥組EGFR 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖9。

圖9 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織EGFR 蛋白表達的影響（×200，±s，n＝3）

4 討論

FD 是一種典型的身心共病的慢性疾病，因其病理的復(fù)雜性及與精神情緒的密切相關(guān)性嚴重影響患者生活質(zhì)量、身心健康。西藥可在短時間內(nèi)改善患者的臨床癥狀，但由于副作用不宜長時間服用，且停藥后較易復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥治療FD 可以從改善消化道癥狀和精神癥狀兩方面同時發(fā)揮作用，不良反應(yīng)小，更適合長期治療，逐漸成為首選的治療方法。

黃芪建中湯作為健脾類經(jīng)典方，建中氣、補脾胃、平調(diào)陰陽，使氣血生化有源，陰陽升降之樞調(diào)和，主要集中于治療消化系統(tǒng)疾?。?6］。當(dāng)機體長期處于精神刺激下可導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)功能失常，出現(xiàn)惡心、嘔吐、納差、腹脹、腹痛等癥狀，稱為腦腸軸分泌異常［17］，被視為FD發(fā)病的重要核心機制之一。GAS、MTL、5-HT 是重要的腦腸肽物質(zhì)，對胃腸功能具有調(diào)節(jié)作用，此外，5-HT 也是參與心理、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)［18］。IL-6 調(diào)控炎癥的多種信號通路，作為重要的炎癥因子，IL-6 在胃黏膜中水平變化也側(cè)面反映了機體的炎癥及受損程度［19］。本研究結(jié)果表明，給藥組小鼠胃排空率及小腸推進率增加，小鼠血清GAS、IL-6 水平降低，MTL、5-HT 水平升高，各組小鼠胃組織病理切片均未見明顯病理現(xiàn)象，與FD 患者臨床癥狀相一致； 但十二指腸組織病理形態(tài)出現(xiàn)不同程度炎癥浸潤現(xiàn)象，與模型組比較，各給藥組均出現(xiàn)不同程度改善，說明黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠腦腸-軸功能紊亂具有改善作用，可促進胃動力，抑制炎癥反應(yīng)，保護小鼠胃腸黏膜。

分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，度值排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素與核心靶點Akt1、VEGFA、CASP3、EGFR 分子生物結(jié)合親和力高，具有較好的藥效活性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到37 個核心靶點，KEGG 主要富集在PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等。PI3K-Akt 信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細胞的凋亡、增生、遷移、分化和代謝。（EGFR是重要的胃黏膜防御因子，是PI3K/Akt 信號通路幾個關(guān)鍵上游調(diào)控蛋白之一［20］。EGFR 通過激活A(yù)kt、PI3K 等下游靶點來調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種重要的生物學(xué)過程，抑制胃酸和胃蛋白分泌，改善胃黏膜血流，降低IL-6水平，保護胃黏膜免受損傷，在胃黏膜的修復(fù)過程中起著重要的作用［21］。本研究結(jié)果顯示，各給藥組十二指腸PI3K-Akt 信號通路被激活、EGFR 蛋白表達上調(diào)，提示可針對FD 癥狀，黃芪建中湯通過上調(diào)EGFR 進而激活作用于PI3K/Akt 生存通路，使胃防御因子啟動自我修復(fù)機制，增強了胃黏膜的修復(fù)水平，發(fā)揮治療的作用。

近年來中醫(yī)藥發(fā)展較快，許多中醫(yī)藥開始廣泛應(yīng)用于FD 的治療中，有效提高了該疾病的治療效果。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了黃芪建中湯治療脾胃虛寒型FD 的關(guān)鍵成分、核心靶點及主要通路，并通過動物模型進行驗證，以期為黃芪建中湯臨床進一步應(yīng)用于治療FD 提供理論依據(jù)。