栗嘉淇，尹 磊，鄭 威，宋孟霜，張 希，孔 兵，許 枬*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600； 2.安徽普仁中藥飲片有限公司，安徽 亳州 236800）

六神曲作為常用健脾中藥，是神曲消食口服液、小兒至寶丸等制劑的主要組成，雖然其活性物質(zhì)與作用機(jī)理目前尚不明確，但一些研究已證實(shí)六神曲具有良好的腸道保護(hù)作用［1-3］。前期報(bào)道，以六神曲為食物添加劑時(shí)，可緩解仔豬斷乳應(yīng)激，改善腸道菌群，提高腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量與血漿抗氧化能力，降低腸黏膜炎癥因子水平，而且副作用比抗生素更小［4］； 可通過減少結(jié)腸黏膜中致病性鞭毛細(xì)菌及其鞭毛蛋白含量，抑制特異性受體TLR5 蛋白表達(dá)，減少內(nèi)臟過敏［5］，還具有抑制LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α 等炎癥因子分泌作用［6］。

成分研究顯示，六神曲活性與發(fā)酵有關(guān)［7-8］。Fu［9］等發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵第7 天六神曲成分與原料成分的相似度僅為0.106，苦杏仁苷、蘆丁等成分被降解，提示發(fā)酵是其產(chǎn)生活性物質(zhì)的重要過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，六神曲發(fā)酵前后多糖類成分發(fā)生顯著變化，其中水溶性多糖含量增加20%以上［10］。為了揭示六神曲多糖活性，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化該成分提取工藝，并采用DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型探索其腸道保護(hù)作用。

1 材料

1.1 儀器 Fresco 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，購自德國Heraeus 公司； BDplus6 流式細(xì)胞儀，購自美國BD Biosciences 公司；Milli-Q IQ 7000 純水儀，購自德國默克公司； U-3010 紫外-可見分光光度計(jì)，購自日本日立公司； 電子天平（十萬分之一），購自德國賽多利斯公司； DHG-9053A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海申賢恒溫設(shè)備廠； HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自常州國華電器有限公司； UX4200S 電子天平，購自上海衡發(fā)實(shí)業(yè)有限公司； ECLIPSE Ts2-FL 倒置生物顯微鏡，購自日本Nikon 公司。

1.2 試劑與藥物 蒽酮、聯(lián)鄰甲苯胺（上海阿拉丁生化材料股份有限公司，批號(hào)K2202111、T818491）； 葡聚糖硫酸鈉（美國MP Biomedicals 公司，批號(hào)S7102）。柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09220302）。APC Rat Anti-mice CD4、PE Rat Anti-mice CD8a、PE Rat Anti-mice Foxp3、4×Fix/Perm Buffer、Diluent Buffer、5×Perm/Wash Buffer （美國BD 公司，批號(hào)553051、553030、563101、562574、562574、562574）； 1×PBS （索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)20210927）。紅細(xì)胞裂解液 ［批號(hào)abs9101，愛必信（上海） 生物科技有限公司］。六神曲、面粉、苦杏仁、赤小豆、辣蓼、青蒿、蒼耳草、麥麩（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號(hào)2112052），經(jīng)安徽普仁飲片有限公司尹磊工程師鑒定為正品，標(biāo)本保存于安徽普仁飲片有限公司。無水葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、乙醚（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長生生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （遼） 2020-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)大連校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)2020041）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取六神曲粉末0.5 g，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇20 mL，加熱回流提取2 h，趁熱過濾，棄濾液，藥渣加50 mL 水，加熱回流提取2 h，趁熱過濾，精密吸取續(xù)濾液3 mL，置于50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品25 mg，置于100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 最大吸收波長確定 精密吸取供試品溶液1 mL、對(duì)照品溶液0.5 mL，置于10 mL 具塞刻度試管中，加水至1.0 mL，搖勻，緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液5 mL，搖勻，迅速置于沸水浴中加熱10 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在400～800 nm 波長范圍內(nèi)掃描吸收曲線。最終確定，最大吸收波長為638 nm。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，各3 份，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，在638 nm 波長處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo) （A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝5.834 3X-0.015 7 （r＝0.999 15），在0.025 4～0.127 0 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 多糖得率測(cè)定 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，平行3 份，置于10 mL 具塞刻度試管中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，在638 nm 波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖得率，，其中C為多糖含量，V為供試品溶液體積，N為稀釋倍數(shù)，M為六神曲粉末質(zhì)量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，在638 nm波長處測(cè)定吸光度6 次，測(cè)得其RSD 為0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別精密量取1.0 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，在638 nm 波長處測(cè)定吸光度，測(cè)得多糖含量RSD 為1.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，于2、4、8、12、24 h 在638 nm 波長處測(cè)定吸光度，測(cè)得多糖含量RSD為1.26%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取9 份多糖含量已知的六神曲粉末，加入一定量對(duì)照品，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密量取1 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法處理，在638 nm 波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.29%，RSD 為1.54%。

2.3 提取工藝優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定初始提取工藝為六神曲細(xì)粉加一定體積分?jǐn)?shù)乙醇提取，棄取醇提液，藥渣加水煎煮，過濾，取上清液，加入乙醇充分?jǐn)嚢?，使含醇量達(dá)80%，室溫靜置24 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、醇提時(shí)間（B）、液料比（C）、水提時(shí)間（D） 為影響因素，多糖得率（Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

通過Design-Expert 13.0 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程為Y＝18.22-1.53A＋0.096 7B＋1.54C＋0.985 0D-0.982 5AB＋0.427 5AC＋1.93AD-0.992 5BC＋0.385 0BD＋1.08CD-2.23A2-2.26B2-2.26C2-2.21D2，方差分析見表3，可行性研究結(jié)果見表4。

表3 方差分析結(jié)果

表4 可行性研究結(jié)果

由表3 可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較??； 各因素及其交互項(xiàng)、二次項(xiàng)均有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。由表4 可知，決定系數(shù)R2、調(diào)整決定系數(shù)AdjR2均大于0.95，表明模型擬合度較高，可替代真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析優(yōu)化。

響應(yīng)面分析見圖1。由此可知，各因素對(duì)多糖得率的影響均呈拋物線形；AC、AD、BC、BD交互的等高線中心呈橢圓形，表明上述兩兩因素交互作用有顯著影響； 各因素影響程度依次為C＞A＞D＞B。

圖1 各因素響應(yīng)面圖

最終確定，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)77.878%，醇提時(shí)間2.003 h，液料比43.729 ∶1，水提時(shí)間2.111 h，多糖得率為18.774%，為了便于實(shí)驗(yàn)操作，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，醇提時(shí)間2 h，液料比44 ∶1，水提時(shí)間2 h。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖得率分別為18.424%、18.826%、18.121%，平均值為18.457%，與預(yù)測(cè)值18.774%接近，表明模型穩(wěn)定性良好，并且所得提取液經(jīng)冷凍干燥后為白色粉末。

2.4 抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用研究

2.4.1 藥液制備

2.4.1.1 多糖 取按“2.3” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備的多糖適量，加水制成0.18 g/mL 溶液，即得（含六神曲生藥量為1 g/mL）。

2.4.1.2 陽性藥 取柳氮磺胺吡啶腸溶片適量，研成細(xì)粉，加水制成混懸液（40 mg/mL），即得。

2.4.1.3 模型 稱取DSS 適量，加蒸餾水制成濃度為2%，振搖，溶解，即得。

2.4.2 分組、造模與給藥 60 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組（400 mg/kg）、六神曲多糖組（1.8 g/kg，折合臨床劑量的6 倍），每組15 只，通過自由飲用“2.4.1.3” 項(xiàng)下藥液來制備慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型?？瞻捉M小鼠全程飲用蒸餾水，其余各組小鼠前5 d 飲用含2% DSS 的蒸餾水，第6 ～10 天改飲蒸餾水，每10 d 為1 個(gè)周期，在第3 個(gè)周期的第7 天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間，陽性藥組、六神曲多糖組小鼠每天分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，空白組、模型組小鼠灌胃給予等體積蒸餾水。末次給藥后，小鼠禁食12 h，麻醉處死，采集組織樣本，記錄結(jié)腸長度，檢測(cè)相應(yīng)生化指標(biāo)。采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA） 結(jié)合t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。

2.4.3 體質(zhì)量、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI） 評(píng)分 每天記錄各組小鼠體質(zhì)量、糞便性狀，每2 d 分析1 次糞便隱血情況［11］，計(jì)算DAI 評(píng)分［12］，公式為DAI 評(píng)分＝ （體質(zhì)量變化評(píng)分＋糞便性狀評(píng)分＋便血評(píng)分）/3，其中體質(zhì)量變化率＝［（測(cè)定時(shí)體質(zhì)量-初始體質(zhì)量） /初始體質(zhì)量］ ×100%，標(biāo)準(zhǔn)見表5。

表5 DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

造模第4 天開始，模型組小鼠糞便開始出現(xiàn)隱血，第7 天時(shí)開始出現(xiàn)肉眼血便； 造模7 d 后，陽性藥組、六神曲多糖組小鼠糞便才開始出現(xiàn)糞便隱血。圖2A 顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)空白組小鼠體質(zhì)量平均增加17.97%； 模型組小鼠體質(zhì)量平均下降18.24%； 陽性藥組、六神曲多糖組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)基本一致，并且其下降率均低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。圖2B 顯示，與空白組比較，模型組小鼠DAI 評(píng)分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，六神曲多糖組小鼠DAI 評(píng)分降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量、DAI 評(píng)分比較

2.4.4 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué) 各組小鼠麻醉處死后剪開腹腔，分離結(jié)腸，測(cè)定長度，再剪取1 cm 左右遠(yuǎn)端結(jié)腸，PBS 緩沖液沖洗后用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋（-80 ℃），切片，HE 染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)，結(jié)果見圖3A。由此可知，空白組小鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，上皮細(xì)胞排列緊密，杯狀細(xì)胞豐富，無炎癥細(xì)胞浸潤； 模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷，隱窩與杯狀細(xì)胞大量消失，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤； 六神曲多糖組、陽性藥組小鼠結(jié)腸黏膜受損較輕，腺體排列基本規(guī)則，杯狀細(xì)胞較多，炎癥細(xì)胞浸潤較少。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化及結(jié)腸長度（HE×100）

結(jié)腸長度見圖3B、表6。由此可知，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸長度縮短（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組、六神曲多糖組小鼠結(jié)腸長度增長（P＜0.05，P＜0.01），以后者更明顯。

表6 各組小鼠結(jié)腸長度比較（±s，n＝15）

表6 各組小鼠結(jié)腸長度比較（±s，n＝15）

注： 與空白組比較，＃＃P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

組別結(jié)腸長度/cm空白組7.30±0.15模型組4.97±0.49＃＃陽性藥組5.90±0.49＃＃*六神曲多糖組6.67±0.59**

2.4.5 脾臟CD4＋/CD8＋、CD4＋Foxp3＋Treg 水平 采用機(jī)械研磨法將小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，經(jīng)離心、重懸、加入Ficoll 試液分層后取淋巴細(xì)胞，過細(xì)胞篩，計(jì)數(shù)，抗體孵育、洗滌，加入核內(nèi)熒光抗體，渦旋，在4 ℃下孵育40 min，PBS 緩沖液洗滌，過篩后采用flowjo 軟件（10.0 版本） 上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由此可知，與空白組比較，模型組小鼠脾臟CD4＋/CD8＋、CD4＋Fopx3＋Treg 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，六神曲多糖組小鼠脾臟兩者升高（P＜0.01），但陽性藥組無明顯變化（P＞0.05）。

圖4 各組小鼠脾臟CD4＋/CD8＋、CD4＋Foxp3＋Treg 水平比較

3 討論

在六神曲傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，有細(xì)菌、曲霉、酵母菌等多種微生物參與［13］，除主料面粉中的淀粉經(jīng)淀粉酶、纖維素酶降解產(chǎn)生次生多糖外［14］，麥麩中阿魏酰阿拉伯木聚糖［15］、酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖均是六神曲多糖來源［16］，可能是六神曲中多糖含量較高的主要原因，但鮮有關(guān)于該成分活性及其結(jié)構(gòu)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化六神曲多糖提取工藝，測(cè)得其得率為18.457%，與預(yù)測(cè)值18.774% 接近，表明工藝準(zhǔn)確可靠，可為后續(xù)該成分活性、構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

多糖類成分不能被腸道直接吸收，往往是被結(jié)腸內(nèi)微生物降解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸或通過抗原提呈來參與T 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)［17］，從而改善腸道菌群，提高腸道免疫［18］，改善腸道健康。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，六神曲多糖能有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸變短、體質(zhì)量降低、疾病指數(shù)增加，提示該成分具有一定的保護(hù)腸道作用。

CD4 為T 輔助細(xì)胞，CD8 為T 殺傷細(xì)胞，兩者相互平衡從而發(fā)揮維護(hù)腸道正常免疫功能［19］。潰瘍性結(jié)腸炎屬于免疫性疾病，患者結(jié)腸黏膜T 淋巴細(xì)胞亞群變化以CD8＋細(xì)胞水平升高、CD4＋/CD8＋下降為主［20］，同時(shí)Treg 細(xì)胞數(shù)降低［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性結(jié)腸炎小鼠給予六神曲多糖后CD4＋/CD8＋升高，接近空白組； Treg 細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3＋水平升高，表明其數(shù)量出現(xiàn)回調(diào)，提示該成分對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的抑制作用可能與調(diào)節(jié)腸道免疫有關(guān)。