李 潔，董丹陽，彭財英，楊 琴，劉建群，舒積成

（江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004）

馬鞭草是一種多年生的草本植物，別名風頸草、鐵馬鞭、馬鞭稍、野荊芥等，始載于《名醫(yī)別錄》，原產(chǎn)于熱帶美洲，在全球分布較廣，中國南方地區(qū)有種植。2020 年版《中國藥典》 載有馬鞭草，其味苦，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有散瘀活血、補肝益腎、利水消腫、退黃、截瘧等功效，常用于治療癥瘕積聚、痛經(jīng)經(jīng)閉、癰腫、喉痹、水腫、黃疸、肝炎、瘧疾等病癥。馬鞭草主要含有環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、黃酮、三萜、甾醇等化合物［1-3］，現(xiàn)代藥理研究表明，苯乙醇苷類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、保肝等作用［4-6］； 馬鞭草提取物可以抑制肝炎病毒［7-8］，臨床上亦有治療病毒性肝炎的案例［9-10］。課題組前期研究顯示，馬鞭草乙酸乙酯化學部位對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護作用。據(jù)此，本研究對馬鞭草乙酸乙酯部位中苯乙醇苷成分進行分離，從中得到9 個苯乙醇苷，可為其深入研究提供依據(jù)。

1 材料

EASY-Nlc1000 LTQ-Orbitrap Elite 型串聯(lián)質(zhì)譜（美國賽默飛世爾公司）； AVANCE III HD 600 MHz型、AVANCE Ⅲ500 MHz 型核磁共振波譜儀（四甲基硅烷為內(nèi)標，瑞士布魯克公司）； 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； LC-100 型制備液相色譜儀（上海伍豐科學儀器有限公司）； C18半制備型色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，北京慧德易科技有限責任公司）； N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （日本EYELA 公司）； SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（杭州庚雨儀器有限公司）； Sephadex LH-20 （美國法瑪西亞公司）； ZF-20D 型暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）； GF254薄層硅膠板、柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）； BS224S型萬分之一電子天平［賽多利斯（北京） 生物科技有限公司］。試劑為分析純或色譜純（西隴科學股份有限公司）； 水為雙蒸水。

馬鞭草購于安徽毫州，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學付小梅教授鑒定為馬鞭草VerbenaofficinalisL.的干燥地上部分。

2 提取與分離

取馬鞭草25 kg，用8 倍量80%乙醇回流提3次，第1 次3 h，后2 次2 h，合并提取液，得浸膏2 658.7 g。取2 650 g，用適量雙蒸水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，回收溶劑，得石油醚部位686.81 g、乙酸乙酯部位400.82 g、正丁醇部位696.91 g。

取乙酸乙酯部位400 g，經(jīng)200 ～300 目硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～5 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識，合并相同流分，得到Fr.1 ～Fr.25。Fr.22 （28.49 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、10 ∶1） 梯度洗脫，合并相同流分，得到Fr.22-1 ～Fr.22-25，F(xiàn)r.22-24（3.32 g） 經(jīng)Sephadex LH-20 分離，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶1） 洗脫，TLC 檢識，合并相同流分，得到Fr.22-24-1 ～Fr.22-24-7，F(xiàn)r.22-24-4 （0.76 g）經(jīng)半制備HPLC 純化，以45%、38%甲醇洗脫（檢測波長230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物2～3 （10.2 mg，tR＝39.92 min）、1 （9.7 mg，tR＝64.13 min）。Fr.25 （12.06 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（8 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、2 ∶1） 梯度洗脫，得到Fr.25-1 ～Fr.25-18，F(xiàn)r.25-9 （6.79 g）經(jīng)Sephadex LH-20 分離，以甲醇純化，得到Fr.25-9-1 ～Fr.25-9-10，F(xiàn)r.25-9-8 （5.88 g） 經(jīng)半制備HPLC 純化，以35%甲醇洗脫（檢測波長230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物4 （689.2 mg，tR＝22.39 min）、5 （58.7 mg，tR＝40.72 min）；Fr.25-9-7 （0.39 g） 經(jīng)半制備HPLC 純化，以33%甲醇洗脫（檢測波長230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物6 （7.2 mg，tR＝27.64 min）、9（9.1 mg，tR＝36.28 min）； Fr.25-9-10 （0.14 g）經(jīng)半制備HPLC 純化，以42% 甲醇洗脫（檢測波長230 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物8（6.8 mg，tR＝14.34 min）、7 （13.5 mg，tR＝19.71 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 淡黃色無定型粉末 （甲醇），UV（CH3OH）λmax227、238、298、324 nm，顯示與苯乙醇苷類似吸收［11］。HR-ESI-MS 顯示該化合物的準離子峰為m/z1 287.470 2 ［M ＋H］＋（計算值1 287.479 6），結(jié)合13C-NMR 數(shù)據(jù)（表1），推測分子式為C62H78O29。1H-NMR （表1） 顯示有1 對反式偶合雙鍵質(zhì)子［δH7.62 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-15），6.36 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-16）］、6個芳香質(zhì)子（歸屬于2 組ABX 偶合系統(tǒng)） ［δH7.13 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），7.00 （1H，dd，J＝1.9，8.2 Hz，H-14），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-13），6.69 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.67 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.61 （1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6）］、2 個糖的端基質(zhì)子［δH5.18 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-24），4.33（1H，d，J＝7.9 Hz，H-18）］。在HMBC 譜中（圖1），葡萄糖端基質(zhì)子（δH4.33） 與苷元C-8（δC72.4） 有偶合相關(guān)，葡萄糖C-6 質(zhì)子 （δH4.37，4.50） 與肉桂酰C-9 （δC169.9，169.2） 有相關(guān)，葡萄糖C-3 （δC84.5，84.0） 與鼠李糖端基質(zhì)子（δH5.18） 有遠程相關(guān)，2 個甲氧基 （δH3.85，3.75） 分別與肉桂酰 C-3 （δC151.6，151.6） 和苷元C-3 （δC147.5，147.5） 有偶合相關(guān)，上述信息顯示，化合物1 的氫譜和片段連接方式與廣防風苷A 相似（同時在本次分離中得到，為化合物3）。然而，在13C-NMR 中顯示近乎2 套廣防風苷A 的碳信號，前期亦有苯乙醇苷二聚體的報道［12-13］，提示化合物1 可能為廣防風苷A 的二倍體，質(zhì)譜顯示其分子量為1 286，將近2 倍于廣防風苷A，進一步驗證上述推測。對比化合物1、3 碳信號，最顯著的差異是肉桂酰片段C-3、C-4 位的化學位移，結(jié)合分子式和文獻［14］，提示化合物1 是由2 個廣防風苷A 通過個肉桂酰基片段的C-4 位相連而形成苯乙醇苷二倍體。綜上所述，化合物1 為一個新的苯乙醇苷二倍體，命名為verbofficoside A。

圖1 化合物1 結(jié)構(gòu)式及關(guān)鍵HMBC 關(guān)聯(lián)（H→C）Fig.1 Structural formula and key HMBC correlation of compound 1 （H→C）

表1 化合物1、3 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compounds 1 and 3

化合物2： 淡黃色無定形粉末（甲醇），ESIMSm/z： 653.2 ［M ＋H］＋，分子式C31H40O15。1HNMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.67 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-7′），7.21 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2′），7.09 （1H，dd，J＝8.2，1.9 Hz，H-6′），6.83 （2H，dd，J＝8.2，5.4 Hz，H-5′），6.75（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2），6.70 （1H，dd，J＝8.2，2.1 Hz，H-6），6.39 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-8′），5.21 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-rham-1），4.39 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-glc-1），3.32 ～3.96（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），3.90（3H，s，-OCH3），3.82 （3H，s，-OCH3），2.87（2H，t，J＝7.2 Hz，H-7），1.11 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元132.9 （C-1），117.1 （C-2），147.5（C-3），147.4 （C-4），112.9 （C-5），121.2 （C-6），36.5 （C-7），72.3 （C-8），56.4 （-OCH3）；酯127.7 （C-1′），111.8 （C-2′），149.4 （C-3′），150.8 （ C-4′），116.5 （ C-5′），124.4 （ C-6′），147.9 （ C-7′），115.1 （ C-8′），168.3 （ C-9′），56.5 （-OCH3）； 葡萄糖104.2 （C-1），76.2 （C-2），81.5 （C-3），70.6 （C-4），76.0 （C-5），62.4 （C-6）； 鼠李糖103.0 （C-1），72.1 （C-2），72.1 （C-3），73.8 （C-4），70.4 （C-5），18.4（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］ 報道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷D。

化合物3： 淡黃色無定形粉末（甲醇），ESIMSm/z： 653.2 ［M ＋H］＋，分子式C31H40O15。1HNMR （600 MHz，CH3OH-d4） 顯示出1 對反式偶合雙鍵質(zhì)子［δH7.64 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-15），6.36 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-16）］，6 個芳香質(zhì)子（歸屬于2 組ABX 偶合系統(tǒng)） ［δH7.16（1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），7.02 （1H，dd，J＝1.9，8.3 Hz，H-14），6.81 （1H，d，J＝8.3 Hz，H-13），6.69 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.67（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.61 （1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6）］，2 個糖的端基質(zhì)子 ［δH4.34 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-18），5.19 （1H，d，J＝1.5 Hz，H-24）］，2 個苯乙醇苷元位的特征信號質(zhì)子［δH2.82 （2H，t，J＝7.2 Hz，H-7）］；13C-NMR （150 MHz，CH3OH-d4） 顯示31 個碳信號，芳香碳有15 個，其中δC169.1 為羧基碳信號，δC104.4 和δC102.7 分別為2 個糖上的端基碳信號，δC56.6 為甲氧基的碳信號。1H-NMR 和13CNMR 數(shù)據(jù)見表1，與文獻［16］ 報道基本一致，故鑒定為廣防風苷A。

化合物4： 棕黃色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：625.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O15。1H-NMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.59 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-7′），7.06 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2′），6.95（1H，dd，J＝8.2，1.9 Hz，H-6′），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5′），6.70 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），6.68 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.56（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.27 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-8′），5.19 （1H，d，J＝1.5 Hz，H-rham-1），4.92 （1H，t，J＝9.5 Hz，H-glc-4），4.37 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-glc-1），2.30 ～3.92（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.79（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），1.09 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元131.4 （C-1），116.3 （C-2），146.1（C-3），144.6 （C-4），117.1 （C-5），121.3 （C-6），36.5 （C-7），72.3 （C-8）； 酯127.6 （C-1′），115.2 （ C-2′），146.8 （ C-3′），149.8 （ C-4′），116.5 （ C-5′），123.2 （ C-6′），114.7 （ C-7′），148.0 （C-8′），168.3 （C-9′）； 葡萄糖104.2 （C-1），76.0 （C-2），81.6 （C-3），70.6 （C-4），76.2 （C-5），62.3 （C-6）； 鼠李糖103.0 （C-1），72.0 （C-2），72.2 （C-3），73.8 （C-4），70.4（C-5），18.4 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［17］ 報道基本一致，故鑒定為毛蕊花糖苷。

化合物5： 棕色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：625.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O15。1H-NMR （600 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.57 （1H，d，J＝15.8 Hz，H-7′），7.04 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.89（1H，dd，J＝2.0，8.2 Hz，H-6′），6.78 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5′），6.68 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），6.64 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.54（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.30 （1H，d，J＝15.9 Hz，H-8′），5.18 （1H，brs，H-rham-1），4.34 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.34 ～4.51（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.79（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），1.25 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （150 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元131.4 （C-1），116.3 （C-2），146.1（C-3），144.6 （C-4），117.1 （C-5），121.3 （C-6），36.7 （C-7），73.4 （C-8）； 酯127.7 （C-1′），115.1 （ C-2′），147.3 （ C-3′），149.6 （ C-4′），116.6 （ C-5′），123.2 （ C-6′），114.8 （ C-7′），146.8 （C-8′），169.1 （C-9′）； 葡萄糖104.4 （C-1），75.7 （C-2），83.9 （C-3），70.4 （C-4），75.4 （C-5），64.6 （C-6）； 鼠李糖102.7 （C-1），72.3 （C-2），72.2 （C-3），74.0 （C-4），70.0（C-5），17.9 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18］ 報道基本一致，故鑒定為異毛蕊花糖苷。

化合物6： 淺棕色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：639.2 ［M＋H］＋，分子式C30H38O15。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.65 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7′），7.08 （1H，brs，H-2′），7.02 （1H，dd，J＝8.5 Hz，H-6′），6.81 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.72 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.69（2H，m，H-2，6），6.36 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-8′），5.19 （1H，brs，H-rham-1），4.37 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.29 ～4.03 （12H，m，rham-2 ～ 5，H-8，glc-2 ～ 6），3.83 （ 3H，s，-OCH3），2.80 （2H，m，H-7），1.09 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-rham-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷C。

化合物7： 淡黃色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：489.2 ［M＋H］＋，分子式C21H28O13。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.54 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7′），7.02 （1H，brs，H-2′），6.91 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6′），6.74 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5′），6.23 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-8′），5.09（1H，brs，H-rham-1），4.52 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），1.05 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OH-d4）δ： 酯127.9（C-1′），115.5 （ C-2′），148.2/148.1 （ C-3′），149.9 （ C-4′），116.8 （ C-5′），123.5 （ C-6′），146.9 （ C-7′），115.1/114.9 （ C-8′），168.7/168.6 （C-9′）； 葡萄糖98.3/94.2 （C-1），74.9/70.9 （C-2），81.9/79.4 （C-3），70.6 （C-4），77.5/76.2 （C-5），62.7/62.6 （C-6）； 鼠李糖103.2 （C-1），71.4 （C-2），72.3 （C-3），74.0（C-4），70.6 （C-5），18.6 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［20］ 報道基本一致，故鑒定為肉蓯蓉苷F。

化合物8： 白色粉末（甲醇），ESI-MSm/z：463.2 ［M＋H］＋，分子式C20H30O12。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 6.80 ～6.67 （2H，m，H-2，5），6.60 （1H，brd，J＝8.0 Hz，H-6），5.19（1H，brs，H-rham-1），4.45 （1H，d，J＝9.0 Hz，H-glc-1），3.21 ～3.96 （12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2～6），2.80 （2H，m，H-7），1.28 （3H，brs，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OH-d4）δ： 苷元131.7 （C-1），117.4 （C-2），146.2 （C-3），144.8 （C-4），116.6 （C-5），121.5 （C-6），36.7 （C-7），72.5 （C-8）； 葡萄糖104.3 （C-1），77.9 （C-2），84.7 （C-3），70.4 （C-4），75.8（C-5），62.9 （C-6）； 鼠李糖102.9 （C-1），72.4（C-2），72.3 （C-3），74.2 （C-4），70.3 （C-5），18.1 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［21］ 報道基本一致，故鑒定為去咖啡?；锘ㄜ?。

化合物9： 無色油狀（甲醇），ESI-MSm/z：593.2 ［M＋H］＋，分子式C29H36O13。1H-NMR （500 MHz，CH3OH-d4）δ： 7.49 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-7′），7.16 （4H，m，H-2 ～6），7.07 （1H，m，H-4），6.96 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.85（1H，dd，J＝2.0，8.0 Hz，H-5′），6.68 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6′），6.17 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-8′），5.10 （1H，brs，H-rham-1），4.28（1H，d，J＝8.0 Hz，H-glc-1），3.18 ～4.02（12H，m，rham-2 ～5，H-8，glc-2 ～6），2.84（2H，t，J＝7.0 Hz，H-7），0.98 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-rham-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OHd4）δ： 苷元140.3 （C-1），129.6 （C-2），130.3（C-3），127.5 （C-4），130.3 （C-5），129.6 （C-6），37.5 （C-7），72.6 （C-8）； 酯127.9 （C-1′），115.0 （ C-2′），150.0 （ C-3′），147.1 （ C-4′），116.8 （ C-5′），123.5 （ C-6′），115.6 （ C-7′），148.3 （C-8′），168.6 （C-9′）； 葡萄糖104.5 （C-1），76.4 （C-2），81.9 （C-3），70.7 （C-4），76.3 （C-5），62.7 （C-6）； 鼠李糖103.3 （C-1），72.3 （C-2），72.6 （C-3），74.1 （C-4），70.9（C-5），18.7 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［22］ 報道基本一致，故鑒定為jionoside C。

4 討論

本研究從馬鞭草乙酸乙酯部位中分離鑒定出9個苯乙醇苷類化合物，包括1 個新的苯乙醇苷二倍體，化合物3、6 ～9 均為首次從該植物中分離得到，進一步豐富了馬鞭草中苯乙醇類化學成分庫。苯乙醇苷具有保肝活性［5］，課題組前期實驗結(jié)果亦表明馬鞭草乙酸乙酯化學部位對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護作用，故該類成分可能為馬鞭草抗肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。課題組后續(xù)也將對含量較高的苯乙醇苷類化合物開展保肝活性實驗，以期進一步驗證上述結(jié)論。

常規(guī)苯乙醇苷（如廣防風苷A） 及其二倍體（廣防風苷A 二倍體） 的反相色譜行為差異較大，后者保留時間明顯長于前者（色譜條件一致，廣防風苷A 為39.9 min，而廣防風苷A 二倍體為64.1 min）。另外，通過肉桂?；蜟-4 相連而形成的廣防風苷A 二倍體在NMR 中有明顯特征，1H-NMR 譜僅顯示單個廣防風苷A 相似數(shù)據(jù)，而13C-NMR 譜卻顯示了2 套廣防風苷A 碳信號，可能是13C-NMR 譜較1H-NMR 譜分辨更高的緣故，上述現(xiàn)象為后續(xù)目標分離和鑒定類似苯乙醇苷二倍體衍生物提供了參考。