劉 冷，賀春花

（荊門市中心醫(yī)院婦科，湖北 荊門 448001）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 是常見于育齡婦女的內分泌疾病，臨床主要特征為高雄激素血癥、少或無排卵、卵巢多囊樣形態(tài)改變和代謝異常（包括胰島素抵抗、肥胖、血脂異常等）［1］。胰島素抵抗（IR） 是指機體胰島素敏感性降低，無法有效刺激葡萄糖處理的病理狀態(tài)，與PCOS 存在一定聯(lián)系［2］，然而其發(fā)病機制復雜，臨床一般針對癥狀進行治療，二甲雙胍為臨床常用藥物，但副作用大［3］。中醫(yī)藥具有療效優(yōu)、不良反應少等特點，已成為治療PCOS 相關IR 的潛在藥物［4-5］。

黃芪甲苷是提取自黃芪的皂苷類化合物，具有抗氧化、降糖、抗炎、抗腫瘤、抗PCOS 等作用［6-7］，可通過抑制氧化應激、調節(jié)性激素合成來實現(xiàn)對PCOS 的治療［7］，然而未對其機制作進一步研究。MAPK/ERK 通路為功能保守的信號傳導途徑，PCOS 顆粒細胞中p-ERK1/2 蛋白表達降低，可能在其病理變化中發(fā)揮作用［8］。因此，本研究通過來曲唑聯(lián)合高脂高糖飲食法構建大鼠肥胖PCOS 模型，探討黃芪皂苷對MAPK/ERK 通路及胰島素抵抗的調控作用，以豐富該成分作用機制研究。

1 材料

1.1 動物 40 只SPF 級雌性SD 大鼠，3 周齡，體質量（50±3） g，購自湖北省實驗動物研究中心［實驗動物生產許可證號SCXK （鄂） 2020-0018］，于湖北夢陽藥業(yè)股份有限公司普通動物房中飼養(yǎng)［實驗動物使用許可證號SYXK （鄂） 2022-0125］，室溫（24±1）℃，相對濕度50% ～60%，自由飲水、進食。研究經(jīng)荊門市中心醫(yī)院動物倫理審查委員會批準（倫理號20210012）。

1.2 試劑和儀器 黃芪皂苷（純度≥90.0%，批號PHL89377，美國默克公司）。來曲唑 （批號20210116，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）； 鹽酸二甲雙胍片（MET） （批號20210325，哈藥集團制藥六廠）； 羧甲基纖維素鈉（CMC） （批號419273，美國Sigma 公司）； 總蛋白提取試劑盒、HE 試劑盒、促卵泡激素 （FSH）、睪酮 （T）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH） ELISA 試劑盒［批號C510003、E607318、D731057、D751045、D741007、D731015，生工生物工程（上海） 股份有限公司］；空腹胰島素 （FINS） ELISA 試劑盒 （批號JM-01993R1，江蘇晶美生物科技有限公司）； 羊抗兔或小鼠IgG 抗體及抗GAPDH、ERK1/2、MEK1/2、Raf、p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2 抗體 ［批號ab205718、ab97023、ab181602、ab184699、ab178876、ab181115、ab173539、ab278564、ab278538，艾博抗（上海） 貿易有限公司］； 羊抗兔IgG （Fluor594）抗體、血管內皮生長因子（VEGF）（批號S0006、AF5131，美國Affinity 公司）。自動酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）； 熒光和普通顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）； 電泳和轉膜裝置（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 肥胖PCOS 大鼠模型制備 參考文獻［9-10］報道，造模組大鼠每天灌胃1 mg/kg 來曲唑（溶于5 g/L CMC 溶液中），并給予高脂飼料和50 g/L 葡萄糖水飼養(yǎng)，連續(xù)30 d； 對照組大鼠灌胃等體積5 g/L CMC 溶液，并給予普通飼料和純水飼養(yǎng)。第23～27 天進行陰道涂片，5 g/L 甲苯胺藍染色，監(jiān)測動情周期，以陰道上皮細胞持續(xù)性角化，排卵周期紊亂為造模成功。確認造模成功后，均從第29天開始給藥。

2.2 分組及給藥 隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、二甲雙胍組（135 mg/kg）［9］和低、高劑量黃芪甲苷組 （25、50 mg/kg）［7］，每組8只，模型組和各給藥組按“2.1” 項下方法進行造模，第29 天開始各給藥組灌胃給予相應劑量藥物（溶于5 g/L CMC 溶液中），對照組和模型組灌胃給予5 g/L CMC 溶液，每天1 次，連續(xù)21 d。

2.3 樣本采集 末次給藥后（第49 天） 稱定大鼠體質量，禁水禁食12 h 后麻醉 （腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉），腹主動脈采血，全血4 ℃離心，收集上層血清后處死，分離左右側卵巢，沖洗干凈后稱定質量，計算卵巢指數(shù)，公式為卵巢指數(shù)＝卵巢質量/大鼠體質量。將左側卵巢置于-80 ℃保存； 右側卵巢浸沒在40 g/L 多聚甲醛中固定，制備卵巢石蠟切片（5 μm）。

2.4 HE 染色觀察卵巢組織形態(tài) 按照HE 試劑盒對卵巢組織石蠟切片進行染色，脫水后封片，在顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學變化。

2.5 血清脂質、性激素和胰島素水平檢測 通過自動生化儀檢測空腹血糖 （FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC） 水平，按照相應ELISA 試劑盒說明書檢測LH、FSH、T、E2、FINS 水平，計算胰島素抵抗指數(shù) （HOMA-IR） 和LH/FSH，前者公式為HOMA-IR＝空腹血糖水平×空腹胰島素水平/22.5。

2.6 Western blot 法檢測卵巢組織 ERK1/2、MEK1/2、Raf 蛋白表達 取50 mg 冷凍保存的卵巢組織，使用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后取30 μg 進行凝膠電泳、轉膜，在室溫下用50 g/L 脫脂奶粉溶液封閉2 h，洗膜后加入一抗GAPDH （1 ∶2 000）、ERK1/2（1 ∶1 000）、MEK1/2（1 ∶1 000）、Raf（1 ∶ 500）、p-Raf （1 ∶ 500）、p-MEK1/2 （1 ∶500）、p-ERK1/2 （1 ∶500），在4 ℃下孵育過夜，洗膜后加入抗兔二抗（1 ∶2 000），在室溫下孵育1 h，加入ECL 發(fā)光液，避光作用5 min，曝光，顯影，通過Image J 軟件分析目的條帶灰度值，以GAPDH 為內參計算目的蛋白相對表達。

2.7 免疫熒光法檢測卵巢組織VEGF 蛋白表達 取卵巢組織切片，經(jīng)脫蠟、蛋白酶K 孵育、抗原修復、血清封閉后加一抗VEGF （1 ∶200），在4 ℃下孵育過夜，加入抗IgG （Fluor594） 二抗，在室溫下避光孵育45 min，洗膜后加入DAPI 復染胞核，在熒光顯微鏡下觀察VEGF 蛋白表達，每張卵巢組織切片隨機取10 個視野（不重疊），通過Image J 軟件分析紅色熒光的光密度。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 動情周期觀察 第23 ～27 天進行陰道涂片，結果如圖1 所示，可知對照組僅在動情期可觀察到大量角質化的上皮細胞，有明顯動情周期，提示排卵周期規(guī)律； 造模組大鼠陰道上皮細胞持續(xù)性角質化，排卵周期紊亂。

圖1 陰道脫落細胞涂片觀察（×400）Fig.1 Observation of exfoliated cells in vaginal smears （×400）

3.2 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠體質量和卵巢指數(shù)的影響 與對照組比較，模型組大鼠體質量、卵巢指數(shù)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠體質量、卵巢指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠體質量、卵巢指數(shù)比較（±s，n＝8）Tab.1 Comparison of rat body weight and ovarian index in each group （±s，n＝8）

表1 各組大鼠體質量、卵巢指數(shù)比較（±s，n＝8）Tab.1 Comparison of rat body weight and ovarian index in each group （±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別體質量/g卵巢指數(shù)/（mg·g-1）對照組264.75±16.7328.53±3.04模型組331.82±19.64**49.61±6.53**低劑量黃芪甲苷組318.12±20.14＃41.37±5.06＃高劑量黃芪甲苷組279.62±20.51＃＃35.96±4.85＃＃二甲雙胍組274.31±17.65＃＃32.85±4.73＃＃

3.3 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠血清脂質水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清TG、TC 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠血清TG、TC 水平降低（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠血清TG、TC 水平比較（mmol/L，±s，n＝8）Tab.2 Comparison of rat serum TG and TC levels in each group （mmol/L，±s，n＝8）

表2 各組大鼠血清TG、TC 水平比較（mmol/L，±s，n＝8）Tab.2 Comparison of rat serum TG and TC levels in each group （mmol/L，±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TCTG對照組1.41±0.260.57±0.06模型組2.47±0.31**1.25±0.11**低劑量黃芪甲苷組2.05±0.24＃＃1.10±0.07＃＃高劑量黃芪甲苷組1.62±0.13＃＃0.73±0.06＃＃二甲雙胍組1.59±0.16＃＃0.68±0.09＃＃

3.4 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠血清性激素水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清LH、FSH、T 水平及LH/FSH 值升高（P＜0.01），E2水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠血清LH、T 水平及LH/FSH值降低（P＜0.05，P＜0.01），E2水平升高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)SH 水平無明顯變化 （P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清LH、FSH、E2、T 水平及LH/FSH 值比較（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of rat serum LH，F(xiàn)SH，E2，T levels and LH/FSH value in each group （±s，n＝8）

表3 各組大鼠血清LH、FSH、E2、T 水平及LH/FSH 值比較（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of rat serum LH，F(xiàn)SH，E2，T levels and LH/FSH value in each group （±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別LH/（ng·L-1）FSH/（U·L-1）LH/FSHE2/（ng·L-1）T/（μg·L-1）對照組42.93±7.3522.76±3.071.89±0.3143.52±2.03105.38±12.43模型組85.46±10.58**30.54±5.18**2.80±0.32**18.29±3.17**149.56±15.72**低劑量黃芪甲苷組73.97±9.04＃29.48±3.732.51±0.18＃23.76±4.83＃134.73±15.18＃高劑量黃芪甲苷組63.12±8.51＃＃27.43±4.052.29±0.19＃＃31.96±5.42＃＃121.44±13.62＃＃二甲雙胍組62.81±7.36＃＃26.81±4.222.34±0.15＃＃34.15±5.76＃＃119.51±14.96＃＃

3.5 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠卵巢組織形態(tài)的影響 對照組大鼠卵巢組織中可見較多不同發(fā)育階段的卵泡細胞，卵泡結構正常，顆粒細胞層較厚，排列緊致； 模型組大鼠卵巢組織中卵泡閉鎖，囊腫性卵泡數(shù)量增加，顆粒細胞層減薄，排列松散，黃體減少或消失； 各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組上述卵巢病變程度緩解，高劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組卵巢形態(tài)接近，見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織HE 染色（×400）Fig.2 HE staining of rat ovarian tissue for each group （×400）

3.6 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠胰島素水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠FINS、FBG 水平及HOMA-IR 值升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠FINS、FBG水平及HOMA-IR 值降低（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠FINS、FGB 水平及HOMA-IR 值比較（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of rat FINS and FGB levels and HOMA-IR value in each group （±s，n＝8）

表4 各組大鼠FINS、FGB 水平及HOMA-IR 值比較（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of rat FINS and FGB levels and HOMA-IR value in each group （±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FINS/（mIU·L-1）FBG/（mmol·L-1）HOMA-IR對照組15.49±1.635.14±0.673.53±0.46模型組26.37±2.85**6.93±0.81**8.12±0.96**低劑量黃芪甲苷組23.86±2.73＃6.18±0.75＃6.50±0.73＃＃高劑量黃芪甲苷組18.46±2.35＃＃5.42±0.63＃＃4.45±0.58＃＃二甲雙胍組17.52±2.46＃＃5.36±0.82＃＃4.17±0.63＃＃

3.7 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠卵巢組織MAPK/ERK 通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織VEGF、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MEK1/2/MEK1/2、p-Raf/Raf 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠VEGF、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MEK1/2/MEK1/2、p-Raf/Raf 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖3、表5。

表5 各組大鼠卵巢組織MAPK/ERK 通路相關蛋白表達比較（±s，n＝8）Tab.5 Comparison of MAPK/ERK pathway related protein expressions in rat ovarian tissues of each group （±s，n＝8）

表5 各組大鼠卵巢組織MAPK/ERK 通路相關蛋白表達比較（±s，n＝8）Tab.5 Comparison of MAPK/ERK pathway related protein expressions in rat ovarian tissues of each group （±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別VEGF/GAPDHp-ERK1/2/ERK1/2p-MEK1/2/MEK1/2p-Raf/Raf對照組0.89±0.050.27±0.030.21±0.040.17±0.02模型組3.96±0.17**0.58±0.09**0.43±0.07**0.39±0.04**低劑量黃芪甲苷組2.18±0.14＃＃0.46±0.06＃＃0.35±0.05＃＃0.31±0.05＃＃高劑量黃芪甲苷組1.47±0.09＃＃0.32±0.08＃＃0.25±0.02＃＃0.22±0.03＃＃二甲雙胍組1.43±0.12＃＃0.31±0.05＃＃0.24±0.03＃＃0.22±0.04＃＃

圖3 各組大鼠卵巢組織MAPK/ERK 通路相關蛋白條帶Fig.3 Protein bands of MAPK/ERK signaling pathway related proteins in rat ovarian tissue of each group

3.8 黃芪甲苷對肥胖PCOS 大鼠卵巢組織VEGF蛋白免疫熒光表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織VEGF 蛋白免疫熒光表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各劑量黃芪甲苷組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織VEGF 蛋白免疫熒光表達降低（P＜0.01），見圖4、表6。

表6 各組大鼠卵巢組織VEGF 蛋白免疫熒光表達比較（±s，n＝8）Tab.6 Comparison of expression of VEGF protein in rat ovarian tissue of each group by immunofluorescence staining （±s，n＝8）

表6 各組大鼠卵巢組織VEGF 蛋白免疫熒光表達比較（±s，n＝8）Tab.6 Comparison of expression of VEGF protein in rat ovarian tissue of each group by immunofluorescence staining （±s，n＝8）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別免疫熒光光密度值對照組241.76±23.58模型組2 486.53±107.95**低劑量黃芪甲苷組1 532.49±71.84＃＃高劑量黃芪甲苷組983.45±63.27＃＃二甲雙胍組957.62±65.41＃＃

圖4 各組大鼠卵巢組織VEGF 蛋白免疫熒光染色Fig.4 Immunofluorescence staining of VEGF protein in rat ovarian tissue of each group

4 討論

PCOS 是一種涉及代謝、內分泌等失衡的慢性全身性疾病，目前多采用動物模型探討其發(fā)病機制或藥物作用機制［11］。來曲唑可抑制芳香酶活性，阻止雄激素向雌激素轉化，連續(xù)作用27～30 d 可引起大鼠出現(xiàn)高雄激素血癥、發(fā)情周期喪失和卵巢PCOS 樣形態(tài)改變，與人類PCOS 病征具有相似性［9］。黃芪甲苷為天然皂苷類化合物，活性優(yōu)于黃芪多糖［6］。既往研究證實，黃芪甲苷可減輕細胞氧化應激［12］、調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)和細胞凋亡［13］、減弱細胞中的IR 和脂質積累［14］、改善糖脂代謝并改善肝功能［15］。本研究HE 結果顯示，模型大鼠卵巢呈現(xiàn)出囊腫性卵泡數(shù)量增加、黃體減少或消失、顆粒細胞層減薄等多囊樣形態(tài)特征，且血清TG、TC、LH、FSH、T 水平及LH/FSH 值升高，同時HOMAIR 值也增高，反映造模成功； 且黃芪甲苷可改善肥胖PCOS-IR 大鼠卵巢形態(tài)，減輕大鼠肥胖程度，提示黃芪甲苷對PCOS 樣卵巢的改善作用。

我國約56.3% 的PCOS 患者存在IR，且肥胖女性IR 發(fā)生率更高，IR 增加與PCOS 嚴重程度呈正相關，是PCOS 臨床癥狀和其他代謝并發(fā)癥發(fā)生的主要病理機制［16-17］。IR 可引起繼發(fā)性代償性高胰島素血癥，導致機體游離雄激素的生物利用度增加，破壞卵泡發(fā)育和顆粒細胞功能［18］。另外，高雄激素血癥也可能加重PCOS 患者的胰島素抵抗［19］，兩者在PCOS 進程中相互影響，共同導致疾病狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能降低肥胖PCOS 大鼠LH、T、FINS、FBG 水平、LH/FSH 和HOMA-IR 值，但是對FSH 的調控效果不佳，提示黃芪甲苷對IR 和高雄激素血癥的改善作用可能是其治療肥胖PCOS 大鼠的機制之一。

IR 的產生和MAPK 通路異?；罨嘘P，通過Ras （上游激活蛋白） -Raf （MAPK/ERK 激酶的激酶） -MEK （MAPK/ERK 激酶） -ERK 酶促級聯(lián)反應，實現(xiàn)信號從胞外到胞內細胞核的傳遞，調控蛋白表達，調節(jié)細胞生長、分裂、發(fā)育等生理活動［20］。PCOS 患者體內IR 的發(fā)生伴隨著MAPK/ERK 通路的異常激活［21］。ERK 通路激活可能導致卵巢過度刺激，產生較多VEGF，引起血管新生，導致卵巢血流異常，體積增大［22-23］。另外，已有研究報道黃芪甲苷對MAPK/ERK 通路活化的抑制作用［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低肥胖PCOS大鼠卵巢組織VEGF、p-Raf/Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK 蛋白表達，表明黃芪甲苷可抑制MAPK/ERK 通路活化，這可能是黃芪甲苷改善肥胖PCOS 大鼠IR 的作用機制。另外，IR 和高雄激素血癥還可能誘導線粒體損傷，打破妊娠子宮內氧化和抗氧化的平衡，導致子宮功能缺陷［25］。本研究主要關注黃芪甲苷對卵巢病變的影響，今后將進一步分析黃芪甲苷對子宮等的保護作用。

綜上所述，黃芪甲苷可抵抗肥胖PCOS 大鼠IR，改善激素水平，減輕其卵巢病變，其機制可能與抑制MAPK/ERK 通路活化有關，豐富了對黃芪甲苷的藥理認識。