楊立敏,李景虹

(1. 青島農業(yè)大學 化學與藥學院,青島 266109;2. 清華大學 化學系,北京 100084)

0 引言

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是細胞分泌的磷脂雙層囊泡,主要分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[1]。目前,“外泌體”常用于指小EVs的混合群體。根據(jù)國際細胞外囊泡協(xié)會的命名建議,本文使用“EVs”表示不同的囊泡。EVs富含來源于親本細胞的生物活性成分,包括脂類、蛋白質和核酸等信息,是細胞間通訊的載體,在不同的生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[2]。EVs廣泛分布于大多數(shù)體液中,是液體活檢的有效生物標志物之一,可用于非侵入性疾病診斷和治療效果監(jiān)測,對疾病診斷及預后監(jiān)測具有重要價值[3]。因此,對EVs及其攜帶生物分子(蛋白質、核酸分子)的分析已成為近年的研究熱點。

本文綜述了基于抗體或核酸適配體的EVs及其表面蛋白質的高靈敏、高特異性檢測新方法;基于傳感探針直接遞送或膜融合介導傳感探針遞送的EVs內部核酸的原位、準確檢測新策略。最后對該領域未來的發(fā)展方向進行了展望。

1 EVs直接分析

EVs是液體活檢的重要生物標志物之一,其直接分析有利于非侵入性疾病的早期診斷?；诳贵w和核酸適配體能夠特異性識別EVs這一特性,研究者們提出了一系列生物傳感新方法用于EVs高靈敏、高選擇性檢測。

1.1 基于抗體的EVs分析方法

抗體可特異性地識別并結合抗原,且對核酸酶降解具有抵抗力,已廣泛應用于生命科學研究、醫(yī)學診斷和疾病治療中。Song等[4]發(fā)展了一種基于表面分子印跡技術的人工磁性膠體抗體用于EVs的快速分離和檢測(圖1(a)),實現(xiàn)了血漿中EVs的靈敏檢測。Jin等[5]利用上轉換納米粒子的光學性質和全內反射熒光成像技術的背景消除特性,實現(xiàn)了單一EV的檢測,見圖1(b)。Lu等[6]將免疫金銀染色技術和泊松分布統(tǒng)計相結合,實現(xiàn)了無需細胞計數(shù)的高通量單一EV分析。Song等[7]結合智能手機開發(fā)了一種快速、靈敏、便攜的生物傳感器用于EVs的定量檢測,見圖1(c)。

圖1 基于抗體的EVs分析方法

為解決臨床EV檢測面臨的樣品制備費力和檢測通量有限等問題,Lee等[8]構建了一種用于從血漿中快速分析腫瘤EVs的集成磁電化學裝置,樣品處理簡單,無需對EVs進行純化,實現(xiàn)了高通量檢測EVs。針對EVs的高度異質性,Zhang等[9]基于磁性納米微球和熒光標記技術,提出了一種簡單的微流控方法用于檢測兩種不同蛋白表達的EVs表型,見圖1(d)。Shi等[10]報道了一種簡便的納米流體活檢測定方法,通過雙特異性生物標記抗原共識別和捕獲策略,實現(xiàn)了對目標腫瘤EVs的準確檢測。

體液中含有高濃度的EVs,但也存在細胞碎片、水溶性或脂溶性代謝物和蛋白酶等干擾物。相比之下,眼淚不含這些干擾物,可認為是一種“更清潔”的液體。建立無需樣品預處理的淚液內EVs檢測方法,實現(xiàn)簡便、快速、高靈敏直接檢測淚液的EVs,對患者進行診斷可能會更方便[11-12]。

1.2 基于核酸適配體的EVs分析方法

利用核酸適配體對EVs表面蛋白的特異性識別,是實現(xiàn)EVs表面蛋白質檢測的有效途徑[13]。Luo等[14]基于DNAzyme觸發(fā)的組裝和去組裝系統(tǒng),通過普通離心方式即可實現(xiàn)EVs高效分離和精確定量,見圖2(a)。Wu等[15]提出了一種流動多價磁界面用于腫瘤EVs的高效分離、超靈敏檢測及蛋白質組學分析。Zhu等[16]開發(fā)了一種兩性離子電致化學發(fā)光傳感界面,實現(xiàn)了免標記檢測EVs,見圖2(b)。

圖2 基于核酸適配體的EVs分析方法

將EVs識別與核酸信號放大策略結合是提高EVs檢測的有效途徑。Yang等[17]開發(fā)了一種基于三維(3D)DNA機器聯(lián)合機器學習算法的新策略,實現(xiàn)了EVs的穩(wěn)定、高靈敏檢測。Wang等[18]以靶標EVs作為3D軌道,以分裂適體作為識別元件,開發(fā)了一種自助式跟蹤的DNA行走器,通過EVs糖蛋白分析實現(xiàn)了免清洗、準確檢測腫瘤EVs,見圖2(c)。

熱泳技術利用溫度梯度下EVs的定向移動,高效地提取純化操作等過程,有利于實現(xiàn)EVs的簡單、快速檢測。Sun等[19]研究了一種熱泳介導的DNA計算裝置用于腫瘤EVs的檢測,見圖2(d)。進一步將雙適體識別、聚乙二醇增強EVs熱泳累積和EVs膜上的AND門操作結合,建立了一步熱泳AND門操作分析方法,無需復雜的樣品制備與預處理,實現(xiàn)了在15 min內的EVs直接檢測[20]。

2 EVs表面蛋白質分析

EVs表面蛋白反映母細胞的信息,可區(qū)分不同的EVs亞群。開發(fā)EVs表面蛋白質的精準定量分析方法,準確解析EVs蛋白異質性和含量,對于疾病的診斷與病情評估具有重要意義。

2.1 基于抗體的EVs表面蛋白質分析

EVs表面多種蛋白質檢測可提供更多的分子信息。Revzin等[21]提出了一種電化學免疫分析方法(圖3(a)),實現(xiàn)了EVs表面兩種蛋白質標志物的定量檢測。Li等[22]基于微陣列的夾心免疫分析,開發(fā)了一種簡單、靈敏的方法用于EVs表面蛋白質的多重檢測。Chen等[23]研究了納米等離子體夾心免疫分析方法,實現(xiàn)了EVs表面程序性死亡配體1(PD-L1)的快速、高靈敏檢測。Qiao等[24]制備了磁性捕獲探針用于高效EVs的捕獲和釋放,實現(xiàn)了原位一步高通量篩選EVs PD-L1。Kelley等[25]提出了一個納米級細胞檢測平臺NanoEPIC,可對血漿中的sEV進行表型分選和sEV PD-L1分析,對單個sEV具有高分辨率能力,見圖3(b)。

圖3 基于抗體識別的EVs表面蛋白質分析

EVs表面單分子標志物表達水平分析有利于鑒定EVs異質性表型。Ko等[26]提出了一種無液滴的高靈敏、雙數(shù)字分析方法,實現(xiàn)了單個EV中絕對定量單個分子?；陔p成像單囊泡技術,可實現(xiàn)單個EV表面蛋白分析和目標特異性EV亞型的量化[27]。Weissleder等[28]提出了一種基于抗體的免疫測序方法,可從單個EVs中對蛋白質分子進行多重測量。

2.2 基于核酸適配體的EVs表面蛋白質分析

利用核酸適配體能夠特異性識別蛋白質這一特性,研究者們提出了多種基于核酸適配體的EVs表面蛋白質分析方法。Zhou等[29]基于可編程的DNA電路提出了一種熒光生物傳感方法,實現(xiàn)了EVs表面PD-L1靈敏、準確測定。Liu等[30]建立了新型比率型電化學分析方法用于EVs表面蛋白質的高靈敏檢測,見圖4(a)。Ye等[31]設計了一種具有多重限制結構的微流控芯片用于EVs的分離富集用于EVs表面蛋白表達量分析。

圖4 基于核酸適配體的EVs表面蛋白質分析

通過多種適配體同時識別多種蛋白質,可建立EVs表面多種蛋白質同時檢測方法[32]?；诰酆厦蛤寗拥倪壿嬓盘柗糯笙到y(tǒng),Zhang等[33]建立了sEV表面蛋白質特異性和超靈敏檢測新方法,見圖4(b)。基于滾環(huán)擴增輔助的流式細胞術方法,可同時識別和分析4個EVs蛋白標志物的細微差別[34]。

大多數(shù)EVs表面蛋白質分析方法需要將EVs進行分離與富集,該過程繁瑣耗時,建立高靈敏、快速、低成本檢測新方法,無需EVs分離提取等操作是EVs相關研究的重點與熱點[35]。Sun等[36]利用微流控熱泳富集及核酸適體識別技術,無需EV分離提取等操作,實現(xiàn)了多種EV膜蛋白的高靈敏、快速、低成本檢測。利用熱泳適體傳感器分析血漿EV的癌癥相關蛋白譜,結合機器學習算法,發(fā)現(xiàn)8個EV蛋白標記的加權總和可準確識別轉移性乳腺癌,見圖4(c)[37]。

3 EVs核酸原位檢測方法

EVs內部核酸的原位檢測可有效避免傳統(tǒng)方法繁瑣的分離與提取步驟,且可防止核酸降解產(chǎn)生的影響,具有高精準性。為實現(xiàn)EVs核酸原位檢測,通常采用直接遞送或膜融合方式將傳感探針遞送至EVs內部。

3.1 基于傳感探針直接遞送的檢測策略

DNA納米探針可直接進入EVs,且能夠將傳感探針限制在局部濃度較高的緊湊空間中,從而提高EVs內核酸檢測的反應速度與靈敏度[38]。為增加傳感探針在DNA納米結構上的數(shù)量,Cao等[39]制備了多分支DNA結構,實現(xiàn)了高靈敏度檢測EVs內miRNA。單一熒光信號易受復雜生物基質的干擾,產(chǎn)生假陽性信號,研究基于熒光共振能量轉移的方法可有效避免此問題,提高檢測準確度[40]。此外,Li等[41]設計合成了一種雙加速DNA級聯(lián)放大器納米結構用于EVs原位、超快和靈敏成像,見圖5(a)。

圖5 基于傳感探針直接遞送的原位檢測EVs核酸策略

基于Au納米顆粒的球形核酸探針在EVs原位檢測方面?zhèn)涫荜P注[42]。Duan等[43]發(fā)現(xiàn)Au納米耀斑探針能夠直接進入EVs,且熒光信號增加,實現(xiàn)人血漿EVs中miRNA原位檢測,見圖5(b)?；贏u納米探針研發(fā)的表面增強拉曼散射策略,可實現(xiàn)原位定量EVs內miRNA,見圖5(c)[44]。

3.2 基于膜融合方式遞送傳感探針的檢測策略

傳感探針直接內化進入EVs的效率有限,可能會影響檢測結果。利用脂質體與EVs膜融合策略,將其裝載的傳感探針遞送至EVs內,是原位檢測EVs內部核酸的另一有效途徑。EVs表面帶有負電荷,制備正電荷表面的脂質體便可通過靜電作用介導二者發(fā)生膜融合,將傳感探針遞送進入EVs內部,實現(xiàn)EVs核酸的原位檢測[45-46]。

在脂質體和EVs上分別修飾核酸,通過拉鏈式DNA雜交也可有效介導膜融合,將傳感探針遞送至EVs內,可縮短反應時間,提高檢測效率,見圖6(a)[47]。EVs具有高度異質性,不同EVs中miRNA的表達水平差異較大,將識別EVs標志物的變構適配體探針作為輸入單元構建正交條形碼,利用智能脂質體探針,可實現(xiàn)腫瘤EVs亞群追蹤及其miRNA原位分型[48]。

圖6 基于膜融合方式遞送傳感探針的原位檢測EVs核酸策略

受到自然囊泡運輸?shù)膯l(fā),Yang等[49]開發(fā)了一種核酸適體介導的選擇性融合策略,用于原位檢測腫瘤EVs內miRNAs,見圖6(b)。此外,Li等[50]基于癌細胞仿生囊泡特異性靶向同源腫瘤細胞分泌的EVs,見圖6(c),實現(xiàn)了循環(huán)EVs內源RNA標志物分選。

4 總結與展望

EVs攜帶豐富的核酸、蛋白質和脂質等生物分子,與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關,是液體活檢的生物標志物之一。EVs及其攜帶生物分子的分析與研究有利于實現(xiàn)非侵入性疾病早期診斷和療效監(jiān)測。隨著對EVs生理和病理作用研究的不斷深入,開發(fā)EVs分析新方法的需求持續(xù)增長。EVs攜帶的核酸與蛋白質等分子可能因其母細胞類型和病理生理狀態(tài)而有很大差異。復雜生物流體中的循環(huán)EVs可能成為多種疾病的診斷、預后和療效監(jiān)測的潛在生物標志物。因此,發(fā)展簡單、快速、高靈敏度、高選擇性的分析方法,實現(xiàn)復雜生物樣品中EVs的高效分離與富集,進一步對其攜帶生物分子進行原位、準確分析,可為探索其生理學功能提供重要的參考信息?？傊?EVs及其攜帶生物分子的分析研究將有助于實現(xiàn)疾病的精準診療。