高小寬 盧 瑤 趙佳明 侯敬儀 李 淼 孟繁松

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

核桃(Juglans regia)為胡桃科核桃屬落葉喬木，核桃青皮為核桃未成熟時(shí)外部的一層厚厚的綠色果皮，其味辛、苦，性平、澀，唐朝《食療本草》記載核桃青皮有一定的藥用價(jià)值[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，核桃青皮具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性[2～4]。在核桃果實(shí)采收后，核桃青皮被當(dāng)作廢棄物堆在田間，持續(xù)污染環(huán)境，危害動(dòng)植物的生存，破壞生態(tài)環(huán)境。但核桃青皮作為一種寶貴的可再利用資源，其很多藥用價(jià)值等待被深入開(kāi)發(fā)和利用[5]。

由Botryosphaeria dothidea Ces.etDeNot.引起的蘋(píng)果輪紋病是一種可同時(shí)危害蘋(píng)果樹(shù)枝干和果實(shí)的病害，近年來(lái)在我國(guó)各大蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，導(dǎo)致蘋(píng)果的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)由于其病菌的潛伏侵染特性，使其成為果實(shí)儲(chǔ)運(yùn)期的重要病害之一[6]。鑒于此，本試驗(yàn)擬在核桃果實(shí)不同成熟期篩選各個(gè)時(shí)期的青皮提取物，研究其對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌的抑菌效果，構(gòu)建核桃青皮最佳抑菌效果期，通過(guò)抑菌活性測(cè)定，找到有效拮抗菌的生長(zhǎng)期，為廢棄核桃青皮資源再利用與抑菌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。從河北昌黎選取10 ～20 株野生核桃樹(shù)，分別從核桃4 個(gè)不同時(shí)期選取核桃青皮：果實(shí)迅速膨大期(5 月初～6 月上旬)、果實(shí)硬核期(6 月初～7月初)、油脂迅速轉(zhuǎn)化期(7 月上旬～8 月下旬)、果實(shí)成熟期(8 月下旬～9 月上旬)分別記做S1、S2、S3、S4。將以上不同生育期的青皮提取物分別用于蘋(píng)果輪紋植物病原菌抑菌試驗(yàn)。供試植物病原菌為蘋(píng)果輪紋植物病原菌，采自衡水舊城村蘋(píng)果園帶病果，經(jīng)儲(chǔ)藏15 d 后取病組織分離得到蘋(píng)果輪紋病菌，4 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃青皮提取物的制備。對(duì)不同生育期的核桃青皮采摘、烘干、粉粹，過(guò)100 目篩。取干燥粉末500 g，加入2 500 ml 蒸餾水，用超聲波提取器提取20 min，兩層紗布過(guò)濾，5 000 r/min 離心15 min，取上清液；殘?jiān)貜?fù)以上處理，取上清液，合并2 次上清液。上清液經(jīng)50 ℃、50 Pa 減壓濃縮，定容到500 ml，滅菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的分離、純化和鑒定。參照方中達(dá)的試驗(yàn)方法[7]。用70%酒精擦拭病果表面，無(wú)菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺(tái)中移到PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃保溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA 培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅。

1.2.3 PDA 培養(yǎng)基制備。參照方中達(dá)方法進(jìn)行[7]。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無(wú)菌水1 000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)瑢ⅠR鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15 ～20 g，加熱熔化加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1 000 ml。分裝后，在0.103 Mpa，121 ℃高溫下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.4 孢子懸浮液制備。取出預(yù)先培養(yǎng)好的備用病原菌，在無(wú)菌條件下，往培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基上加入含有0.01%Tween80 的無(wú)菌水10 ml，用已消毒的毛筆將互隔交鏈孢孢子從培養(yǎng)皿上輕輕刮下，制成濃度為1×106CFU/ml 的孢子懸浮液，懸浮液孢子計(jì)數(shù)采用在10×10 倍顯微鏡下每視野30～35 個(gè)分生孢子的方式。

1.2.5 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法，在無(wú)菌條件下，分別稱取0.062 5 ml、0.125 ml、0.25 ml、0.5 ml、1 ml 核桃青皮提取物，加入100 ml的PDA 培養(yǎng)基中，搖勻后趁熱倒入直徑90 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)。預(yù)先培養(yǎng)蘋(píng)果輪紋病菌，滅菌后用直徑為6 mm 打孔器在菌落邊沿處鉆取適量菌齡相同的菌餅[8]，接種于含有殺菌劑的PDA 培養(yǎng)基的中央，菌絲面向下，每皿接種1 個(gè)菌餅，同等濃度做3 次重復(fù)試驗(yàn)。25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑，觀察記錄培養(yǎng)6 d 的結(jié)果。繪制每天菌落的生長(zhǎng)量曲線和計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的抑制率。CK作為對(duì)照。菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)]/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel 表格，將核桃青皮提取液濃度的對(duì)數(shù)設(shè)置為橫軸，將抑制率幾率值設(shè)置為縱軸并作圖，得出毒力回歸方程及有效抑制濃度(EC50)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期核桃青皮提取液對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。不同生育期核桃青皮提取液對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。不同生育時(shí)期的核桃青皮提取液對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌抑制率隨著濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。均在0.5 ml/100 ml 時(shí)抑菌效果較好，其中生育期為S3 的核桃青皮提取液在濃度為0.5 ml/100 ml 時(shí)抑制率達(dá)到最高值，為47.59，其次是生育期為S2 的抑制率較好，值為41.30。

表1 不同生育期核桃青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制率

2.2 不同生育期核桃青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定。由表2 可知，4 個(gè)不同生育期的核桃青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均高于0.9000，說(shuō)明該試驗(yàn)具有較高的精密度。由各時(shí)期的EC50值可知，生育期為7 月份的青皮提取物的抑菌效果最好，毒力最強(qiáng)，值為1.608 1，相關(guān)系數(shù)為0.953 4。

表2 不同生育期青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

2.3 核桃青皮提取物對(duì)病原孢子萌發(fā)的抑制。由表3可知，不同核桃青皮提取物濃度對(duì)蘋(píng)果輪紋病原的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制結(jié)果與菌絲結(jié)果相符，提取物濃度與相對(duì)病原的孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。提取物濃度在0.5 ml/100 ml 和1 ml/100 ml 時(shí)的孢子萌發(fā)率都為60%以上，在濃度為0.062 5 ml/100 ml時(shí)的孢子萌發(fā)率僅為19.33%。結(jié)果表明，核桃青皮提取物在高濃度條件下，對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用。

表3 核桃青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原孢子萌發(fā)的抑制效果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論，不同生育期的核桃青皮提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病的菌落生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制效果。其中，對(duì)菌落生長(zhǎng)抑菌效果最好的是S3生育期的核桃青皮提取物，其濃度為0.5 ml/100 ml，此時(shí)期提取物的抑菌率可達(dá)到47.59%，對(duì)病原菌的毒力最強(qiáng)，EC50為1.608 1 mg/100 ml。