高小寬 盧 瑤 趙佳明 侯敬儀 李 淼 孟繁松

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

核桃(Juglans regia)為胡桃科核桃屬落葉喬木，核桃青皮為核桃未成熟時(shí)外部的一層厚厚的綠色果皮，其味辛、苦，性平、澀，唐朝《食療本草》記載核桃青皮有一定的藥用價(jià)值[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，核桃青皮具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性[2～4]。在核桃果實(shí)采收后，核桃青皮被當(dāng)作廢棄物堆在田間，持續(xù)污染環(huán)境，危害動(dòng)植物的生存，破壞生態(tài)環(huán)境。但核桃青皮作為一種寶貴的可再利用資源，其很多藥用價(jià)值等待被深入開發(fā)和利用[5]。

由Botryosphaeria dothidea Ces.etDeNot.引起的蘋果輪紋病是一種可同時(shí)危害蘋果樹枝干和果實(shí)的病害，近年來在我國各大蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，導(dǎo)致蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)由于其病菌的潛伏侵染特性，使其成為果實(shí)儲(chǔ)運(yùn)期的重要病害之一[6]。鑒于此，本試驗(yàn)擬在核桃果實(shí)不同成熟期篩選各個(gè)時(shí)期的青皮提取物，研究其對蘋果輪紋病病原菌的抑菌效果，構(gòu)建核桃青皮最佳抑菌效果期，通過抑菌活性測定，找到有效拮抗菌的生長期，為廢棄核桃青皮資源再利用與抑菌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。從河北昌黎選取10 ～20 株野生核桃樹，分別從核桃4 個(gè)不同時(shí)期選取核桃青皮：果實(shí)迅速膨大期(5 月初～6 月上旬)、果實(shí)硬核期(6 月初～7月初)、油脂迅速轉(zhuǎn)化期(7 月上旬～8 月下旬)、果實(shí)成熟期(8 月下旬～9 月上旬)分別記做S1、S2、S3、S4。將以上不同生育期的青皮提取物分別用于蘋果輪紋植物病原菌抑菌試驗(yàn)。供試植物病原菌為蘋果輪紋植物病原菌，采自衡水舊城村蘋果園帶病果，經(jīng)儲(chǔ)藏15 d 后取病組織分離得到蘋果輪紋病菌，4 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃青皮提取物的制備。對不同生育期的核桃青皮采摘、烘干、粉粹，過100 目篩。取干燥粉末500 g，加入2 500 ml 蒸餾水，用超聲波提取器提取20 min，兩層紗布過濾，5 000 r/min 離心15 min，取上清液；殘?jiān)貜?fù)以上處理，取上清液，合并2 次上清液。上清液經(jīng)50 ℃、50 Pa 減壓濃縮，定容到500 ml，滅菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的分離、純化和鑒定。參照方中達(dá)的試驗(yàn)方法[7]。用70%酒精擦拭病果表面，無菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺(tái)中移到PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃保溫培養(yǎng)，待長出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA 培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅。

1.2.3 PDA 培養(yǎng)基制備。參照方中達(dá)方法進(jìn)行[7]。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1 000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15 ～20 g，加熱熔化加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1 000 ml。分裝后，在0.103 Mpa，121 ℃高溫下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.4 孢子懸浮液制備。取出預(yù)先培養(yǎng)好的備用病原菌，在無菌條件下，往培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基上加入含有0.01%Tween80 的無菌水10 ml，用已消毒的毛筆將互隔交鏈孢孢子從培養(yǎng)皿上輕輕刮下，制成濃度為1×106CFU/ml 的孢子懸浮液，懸浮液孢子計(jì)數(shù)采用在10×10 倍顯微鏡下每視野30～35 個(gè)分生孢子的方式。

1.2.5 對菌絲生長的抑制活性測定。采用菌絲生長速率法，在無菌條件下，分別稱取0.062 5 ml、0.125 ml、0.25 ml、0.5 ml、1 ml 核桃青皮提取物，加入100 ml的PDA 培養(yǎng)基中，搖勻后趁熱倒入直徑90 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)。預(yù)先培養(yǎng)蘋果輪紋病菌，滅菌后用直徑為6 mm 打孔器在菌落邊沿處鉆取適量菌齡相同的菌餅[8]，接種于含有殺菌劑的PDA 培養(yǎng)基的中央，菌絲面向下，每皿接種1 個(gè)菌餅，同等濃度做3 次重復(fù)試驗(yàn)。25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量供試真菌菌落生長直徑，觀察記錄培養(yǎng)6 d 的結(jié)果。繪制每天菌落的生長量曲線和計(jì)算菌絲生長的抑制率。CK作為對照。菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)]/對照菌落直徑×100%。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel 表格，將核桃青皮提取液濃度的對數(shù)設(shè)置為橫軸，將抑制率幾率值設(shè)置為縱軸并作圖，得出毒力回歸方程及有效抑制濃度(EC50)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期核桃青皮提取液對蘋果輪紋病菌菌絲生長的影響。不同生育期核桃青皮提取液對蘋果輪紋病菌菌絲生長的影響見表1。不同生育時(shí)期的核桃青皮提取液對蘋果輪紋病菌抑制率隨著濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。均在0.5 ml/100 ml 時(shí)抑菌效果較好，其中生育期為S3 的核桃青皮提取液在濃度為0.5 ml/100 ml 時(shí)抑制率達(dá)到最高值，為47.59，其次是生育期為S2 的抑制率較好，值為41.30。

表1 不同生育期核桃青皮提取物對蘋果輪紋病菌的抑制率

2.2 不同生育期核桃青皮提取物對蘋果輪紋病菌的室內(nèi)毒力測定。由表2 可知，4 個(gè)不同生育期的核桃青皮提取物對蘋果輪紋病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均高于0.9000，說明該試驗(yàn)具有較高的精密度。由各時(shí)期的EC50值可知，生育期為7 月份的青皮提取物的抑菌效果最好，毒力最強(qiáng)，值為1.608 1，相關(guān)系數(shù)為0.953 4。

表2 不同生育期青皮提取物對蘋果輪紋病菌的室內(nèi)毒力測定

2.3 核桃青皮提取物對病原孢子萌發(fā)的抑制。由表3可知，不同核桃青皮提取物濃度對蘋果輪紋病原的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制結(jié)果與菌絲結(jié)果相符，提取物濃度與相對病原的孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。提取物濃度在0.5 ml/100 ml 和1 ml/100 ml 時(shí)的孢子萌發(fā)率都為60%以上，在濃度為0.062 5 ml/100 ml時(shí)的孢子萌發(fā)率僅為19.33%。結(jié)果表明，核桃青皮提取物在高濃度條件下，對蘋果輪紋病病原孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用。

表3 核桃青皮提取物對蘋果輪紋病病原孢子萌發(fā)的抑制效果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論，不同生育期的核桃青皮提取物對蘋果輪紋病的菌落生長均具有不同程度的抑制效果。其中，對菌落生長抑菌效果最好的是S3生育期的核桃青皮提取物，其濃度為0.5 ml/100 ml，此時(shí)期提取物的抑菌率可達(dá)到47.59%，對病原菌的毒力最強(qiáng)，EC50為1.608 1 mg/100 ml。