牛慶玲,王雅莉,王 卓

(鄭州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科, 河南 鄭州 450007)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,由于早期無明顯臨床癥狀,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)展為晚期[1]。初始治療后患者3年累積復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%,5年總生存率不足50%,化療耐藥是該病高復(fù)發(fā)率和高病死率的根本原因[2]。吉西他濱(gemcitabine,GEM)是阿糖胞苷類似物,臨床不良反應(yīng)少,可延長卵巢癌復(fù)發(fā)患者的無進(jìn)展生存期,改善預(yù)后[3]。芥子堿硫氰酸鹽是提取自萊菔子的生物堿,具有抗炎、抗氧化和抗血管生成作用[4]。近年來有實(shí)驗(yàn)[5]表明,其可抑制膠質(zhì)瘤T98細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤功效。但目前關(guān)于其對(duì)腫瘤細(xì)胞化療增敏的影響鮮有報(bào)道,且缺乏相應(yīng)機(jī)制研究。本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3吉西他濱耐藥細(xì)胞(SKOV3/GEM細(xì)胞),觀察芥子堿硫氰酸鹽對(duì)SKOV3細(xì)胞GEM敏感性的影響,探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器

芥子堿硫氰酸鹽,純度98%,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)SS9190;表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激動(dòng)劑NSC 228155,上海滬崢生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)113104-25-9;GEM,仁合熙德隆藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)022306302;兔抗人血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、Eph受體酪氨酸激酶A2(Ephreceptor tyrosine kinase A2,EphA2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化EGFR(phosphorylated EGFR,p-EGFR)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR (phospho-mTOR,p-mTOR)一抗,均為美國艾博抗公司產(chǎn)品,批號(hào)依次為ab205336、ab212069、ab52894、ab32086、ab38449、ab8805、ab134903、ab278621。Epoch酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品;Cyto FLEX2流式細(xì)胞儀,美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品;BX53光學(xué)顯微鏡,日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.3 SKOV3/GEM細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

按照參考文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行。取人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株,溫水浴解凍,置于RPMI-1640培養(yǎng)基(100 mL/L 胎牛血清,青霉素和鏈霉素各100 U/mL),在37 ℃、50 mL/L CO2條件下培育,待細(xì)胞融合至80%,胰酶消化、傳代;取對(duì)數(shù)期細(xì)胞培育耐藥細(xì)胞株。采用濃度遞增法建立SKOV3細(xì)胞吉西他濱耐藥株SKOV3/GEM,培養(yǎng)液內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 mg/L的GEM,培養(yǎng)48 h;棄培養(yǎng)基,更換為完全培養(yǎng)基使細(xì)胞恢復(fù)生長,再次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 mg/L的GEM;反復(fù)提高藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5、10、20、40 mg/L)換液傳代,直至細(xì)胞可穩(wěn)定生長于RPMI-1640培養(yǎng)液中(GEM最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 mg/L),后續(xù)實(shí)驗(yàn)開始前一周更換為完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)期SKOV3/GEM細(xì)胞,清洗,重懸,以1×105個(gè)/mL接種于96孔板,待細(xì)胞融合至80%,隨機(jī)分為耐藥組、干預(yù)組、激動(dòng)劑組、聯(lián)合組。耐藥組以完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),干預(yù)組培養(yǎng)基加入芥子堿硫氰酸鹽(終濃度100 μmol/L),激動(dòng)劑組培養(yǎng)基加入NSC228155(終濃度100 μmol/L),聯(lián)合組培養(yǎng)基加入芥子堿硫氰酸鹽(100 μmol/L)和NSC 228155(100 μmol/L)。各組均干預(yù)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 SKOV3、SKOV3/GEM細(xì)胞的GEM敏感性

采用CCK-8法檢測不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GEM下SKOV3、SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率。分別取對(duì)數(shù)期SKOV3、SKOV3/GEM細(xì)胞,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗,胰酶消化,重懸,以1×105個(gè)/mL接種于96孔板,待細(xì)胞融合至80%,每孔加入含GEM(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是10、50、100、200、400 mg/L)RPMI-1640培養(yǎng)液,48 h后加入10 μL CCK-8溶液,4 h后吸棄上清,加入二甲基亞砜振蕩5 min,采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值,計(jì)算增殖抑制率和半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。增殖抑制率(%)=(1-各質(zhì)量分?jǐn)?shù)GEM孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%

1.4.2 各組SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率

按1.3項(xiàng)下分組。采用CCK-8法檢測。取干預(yù)后的各組細(xì)胞,洗滌,重懸,接種,加入終濃度為400 mg/L的GEM,培養(yǎng)48 h后,加入CCK-8試劑繼續(xù)孵育4 h,經(jīng)酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值,計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.4.3 SKOV3/GEM細(xì)胞凋亡率

取干預(yù)后的各組SKOV3/GEM細(xì)胞,清洗,重懸后,以1×105個(gè)/mL接種于6孔板,加入終濃度400 mg/L的GEM,常規(guī)培養(yǎng)48 h,PBS清洗,低溫離心機(jī)離心(半徑10 cm,2 500 r/min)8 min,棄上清,結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V、碘化丙啶各5 μL,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞血管生成能力

通過血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測。取Matrigel 膠,4 ℃過夜解凍,與RPMI-1640培養(yǎng)液融合后鋪于96孔板,取干預(yù)后的各組SKOV3/GEM細(xì)胞,胰酶消化、重懸,以1×104個(gè)/mL接種至該孔板,培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)24 h,光鏡下選取5個(gè)不相鄰視野拍照,觀察各組細(xì)胞血管生成情況。

1.4.5 VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)量

取干預(yù)后的各組SKOV3/GEM細(xì)胞,PBS清洗后移至離心管,加入RIPA裂解液,以10 cm離心半徑、10 000 r/min轉(zhuǎn)速低溫離心15 min,經(jīng)BCA試劑盒測量總蛋白并定量。取40 μg待測蛋白,混合4倍體積上樣緩沖液,沸水浴變性蛋白,離心取上清,加載至聚丙烯酰胺凝膠,恒壓下電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜,50 mL /L脫脂牛奶封閉2 h,加入兔抗人VE-cadherin、EphA2一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,TBST緩沖液清洗,加入二抗(1∶2 000),搖床孵育2 h,TBST緩沖液清洗,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光,暗室顯影,采用成像分析儀分析蛋白條帶灰度值。以VE-cadherin、EphA2蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值代表該蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)量

取干預(yù)后的各組SKOV3/GEM細(xì)胞,清洗,裂解,定量,變性,電泳分離,轉(zhuǎn)膜,封閉,方法同1.4.5;加入兔抗人EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,TBST緩沖液清洗,加入二抗(1∶2 000),搖床孵育2 h,TBST緩沖液清洗,電化學(xué)發(fā)光液發(fā)光,暗室顯影,經(jīng)成像分析儀分析蛋白條帶灰度值,以EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值代表該蛋白相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GEM下SKOV3、SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GEM下,SKOV3、SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率低于SKOV3細(xì)胞(P<0.01)。見表1。SKOV3/GEM細(xì)胞IC50為(210.59±15.24)mg/L,高于SKOV3細(xì)胞(78.57±9.15)mg/L,表明耐藥株SKOV3/GEM建立成功。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)GEM下SKOV3、SKOV3GEM細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比

2.2 各組SKOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比

與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組KOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.01),激動(dòng)劑組KOV3/GEM增殖抑制率降低(P<0.01);與干預(yù)組對(duì)比,聯(lián)合組增殖抑制率降低(P<0.01);與激動(dòng)劑組對(duì)比,聯(lián)合組增殖抑制率升高(P<0.01)。結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽可抑制SKOV3/GEM細(xì)胞增殖。見表2。

表2 各組KOV3/GEM細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比

2.3 各組SKOV3/GEM細(xì)胞凋亡率對(duì)比

與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組SKOV3/GEM細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01),激動(dòng)劑組凋亡率降低(P<0.01);與干預(yù)組對(duì)比,聯(lián)合組凋亡率降低(P<0.01);與激動(dòng)劑組對(duì)比,聯(lián)合組凋亡率升高(P<0.01)。結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽可促進(jìn)SKOV3/GEM細(xì)胞凋亡。見表3。

表3 各組SKOV3/GEM細(xì)胞凋亡率對(duì)比

2.4 各組細(xì)胞血管生成能力對(duì)比

與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量/視野減少(P<0.01),激動(dòng)劑組管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量/視野增加(P<0.01);與干預(yù)組對(duì)比,聯(lián)合組管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量/視野增加(P<0.01);與激動(dòng)劑組對(duì)比,聯(lián)合組管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量/視野減少(P<0.01)。見表4、圖1。結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽可降低細(xì)胞血管生成能力。

圖1 血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞新生管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量(×200,標(biāo)尺50 μm)

表4 各組細(xì)胞血管生成能力對(duì)比 個(gè),

2.5 各組SKOV3/GEM細(xì)胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)對(duì)比

與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)降低(P<0.01),激動(dòng)劑組VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)升高(P<0.01);與干預(yù)組對(duì)比,聯(lián)合組VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)升高(P<0.01);與激動(dòng)劑組對(duì)比,聯(lián)合組VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽通過抑制EGFR/PI3K通路抑制細(xì)胞血管生成。見表5、圖2。

圖2 細(xì)胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)量

表5 各組SKOV3/GEM細(xì)胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)對(duì)比

2.6 各組KOV3/GEM細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR對(duì)比

與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01),激動(dòng)劑組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);與干預(yù)組對(duì)比,聯(lián)合組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);與激動(dòng)劑組對(duì)比,聯(lián)合組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01)。結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽對(duì)細(xì)胞的影響通過抑制EGFR/PI3K通路實(shí)現(xiàn)。見表6、圖3。

圖3 細(xì)胞p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)量

表6 各組KOV3/GEM細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR對(duì)比

3 討 論

卵巢癌多發(fā)于卵巢上皮組織,可直接浸潤至鄰近組織器官,累及輸卵管、膀胱、子宮及直腸,晚期則可通過血液轉(zhuǎn)移至全身各處[8]。因當(dāng)前缺乏準(zhǔn)確篩查早期卵巢癌的有效工具,加之其無癥狀發(fā)展的特點(diǎn),多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期,治療后復(fù)發(fā)現(xiàn)象嚴(yán)重,探索提升復(fù)發(fā)患者化療效果的新輔助藥物勢在必行。GEM是一種周期特異性抗癌藥物,進(jìn)入細(xì)胞后可生成競爭性底物摻入DNA,從而抑制DNA復(fù)制,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]。其耐藥機(jī)制尚未完全闡明,多認(rèn)為與糖酵解活化、凋亡抑制蛋白升高、DNA損傷修復(fù)、信號(hào)通路改變及血管新生加劇有關(guān),其中腫瘤血管生成被認(rèn)為是其重要機(jī)制之一,可激活休眠腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤微環(huán)境建立,提升惡化潛能,從而降低藥物敏感性[10]。因此,尋找高效抑制血管新生的藥物是降低卵巢癌化療耐藥、提升治療效果的關(guān)鍵。

VE-cadherin、EphA2是血管新生相關(guān)蛋白,其含量與血管生成擬態(tài)形成呈正相關(guān),可代表腫瘤細(xì)胞血管生成能力[11]。卵巢癌屬中醫(yī)學(xué)“積聚”等范疇,主要病機(jī)為脾腎虧虛導(dǎo)致瘀阻于內(nèi),氣滯血瘀,治療可從活血化瘀、健脾通絡(luò)方面著手[12]。萊菔子性平,味辛、甘,歸脾、胃經(jīng),可健脾理氣,導(dǎo)滯通絡(luò),具有抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)胃腸行氣等作用[13]。萊菔子提取物芥子堿硫氰酸鹽可抑制凝血并平衡纖維蛋白溶解,抑制纖維蛋白生成與沉積,從而抑制血管新生[14]。孫遠(yuǎn)梅等[15]研究認(rèn)為,芥子堿硫氰酸鹽可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞化療藥物外排并降低多耐藥蛋白表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)化療耐藥,提示其或可成為腫瘤細(xì)胞潛在增敏藥物。本研究結(jié)果顯示,與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組增殖抑制率、凋亡率升高,血管生成能力、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)降低,提示芥子堿硫氰酸鹽可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞GEM耐藥,抑制血管生成,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

EGFR是受體酪氨酸激酶家族成員,是一種細(xì)胞生理信號(hào)受體蛋白,與配體結(jié)合后發(fā)生二聚化反應(yīng)磷酸化,與下游蛋白PI3K調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合,使其釋放出催化亞基p110,與其他因子共同作用招募效應(yīng)蛋白Akt至細(xì)胞內(nèi)膜,Akt位點(diǎn)磷酸化后激活蛋白激酶mTOR,p-mTOR直接作用于底物蛋白,發(fā)揮促增殖、促侵襲、抗凋亡及促血管生成的作用[16]。Fu等[17]研究認(rèn)為,抑制EGFR/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可促進(jìn)食管癌吉非替尼耐藥細(xì)胞凋亡、抑制其增殖,提高食管癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,提示該通路或可成為抑制腫瘤細(xì)胞耐藥新靶點(diǎn)。NSC228155是EGFR激活劑,可誘導(dǎo)EGFR的磷酸化,進(jìn)而影響下游信號(hào)分子表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,與耐藥組對(duì)比,干預(yù)組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低,在芥子堿硫氰酸鹽基礎(chǔ)上增用EGFR激活劑NSC 228155可減弱芥子堿硫氰酸鹽對(duì)卵巢癌的GEM增敏作用,提示芥子堿硫氰酸鹽可能通過介導(dǎo)該通路抑制卵巢癌細(xì)胞血管生成并降低其GEM耐藥性。

綜上所述,芥子堿硫氰酸鹽可抑制卵巢癌細(xì)胞血管生成并提升GEM化療敏感性,抑制EGFR/PI3K信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一。