龔夢潔, 海 瀅, 呂凱文, 顧洪斌, 祖莉莉*

1. 北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 北京 100875

2. 戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心血管外科, 北京 100101

引 言

抗凝藥物在治療及預(yù)防血栓相關(guān)的疾病以及心臟和血管支架植入術(shù)后治療中有著十分廣泛的應(yīng)用[1-5]。 傳統(tǒng)抗凝藥物非特異性靶向于凝血級聯(lián)的多個凝血因子, 主要包括肝素、 維生素K拮抗劑等。 這類抗凝藥在使用中需要頻繁監(jiān)測凝血情況并實時調(diào)整用藥劑量, 以防止藥物導(dǎo)致的出血風(fēng)險[1-2]。 近年來, 直接作用于特定凝血因子、 不需要常規(guī)凝血監(jiān)測的口服抗凝血藥物的研究和應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注[2-4]。 其中, 達比加群酯(Dabigatran etexilate, DE)是目前新型口服抗凝藥中唯一一個直接特異性靶向于凝血級聯(lián)最后一環(huán)凝血酶(Thrombin, Thr)的藥物[1, 5]。 達比加群酯本身沒有藥理活性, 口服后可被迅速吸收, 在血漿和肝臟被羧酸酯酶催化水解為活性成分達比加群[5-6]。 達比加群藥物的口服抗凝效果得到了廣泛印證, 近年來被多個國家批準(zhǔn)臨床使用[7]。 隨著藥物的使用, 研究達比加群與凝血酶在生理條件下的反應(yīng)動力學(xué)是尋找達比加群特定逆轉(zhuǎn)劑以應(yīng)對緊急手術(shù)或消化道出血等情況的迫切需要[1-2, 7]。

達比加群(Dabigatran, DAB)是一個三取代的苯并咪唑化合物, 分子包含苯甲脒和羧基兩個極性基團[圖1(a)]。 藥理研究顯示DAB可直接與凝血酶結(jié)合, 阻止其催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的活性, 從而達到抗凝血效果[1, 8]。 為了改善DAB的口服藥效, 將其極性基團酯化, 成為其前藥達比加群酯DE[5]。

圖1 (a) 達比加群, (b) 達比加群酯

然而, 極性基團在DAB抗凝過程中的作用機制仍存在很大爭議。 Hauel等研究了DAB與凝血酶復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)[5], 在DAB的苯甲脒和凝血酶的Asp189之間觀察到一個鹽橋, 而DAB的羧基與凝血酶沒有氫鍵相互作用, 提出DAB與凝血酶的結(jié)合主要是通過疏水相互作用; 另一方面, 藥物試驗的結(jié)果顯示, 在DAB的苯并咪唑模板中引入羧基顯著提高了藥物在體內(nèi)的活性和抗凝效果。 Naik等研究了DAB與人血清白蛋白、 核糖二氫煙酰胺脫氫酶等人體中其他蛋白及酶的相互作用[9-10], 提出極性基團提高DAB抗凝血能力的原因可能與增強了DAB與凝血酶結(jié)合的特異性有關(guān)。 Remko等的理論研究發(fā)現(xiàn), 水對DAB和DE的幾何結(jié)構(gòu)有很大影響[11-12]。 已有的研究結(jié)果表明： DAB和凝血酶在生理條件下相互作用的直接研究是探索疏水作用和極性作用在DAB與凝血酶結(jié)合過程中的動力學(xué)機理的迫切需要。

本工作中, 我們運用穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜研究了DAB和凝血酶在模擬生理條件下(pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中)的相互作用, 通過對DAB分子極性基團的酯化探究影響DAB抗凝效率的動力學(xué)因素; 基于凝血酶與DAB極性基團酯化前后的分子對接模擬, 分析兩者相互作用時分子構(gòu)象變化對結(jié)合能的影響, 闡述DAB的抗凝機理; 通過DAB與牛血清白蛋白相互作用的對比實驗驗證DAB與凝血酶結(jié)合的特異性。

1 實驗部分

達比加群(≥98%)、 達比加群酯(>99%)、 達比加群乙酯(≥99%)購自上海麥克林生化科技有限公司。 凝血酶(1 000 U, 比活性>2 000 U·mg-1蛋白質(zhì))購自大連美倫生物科技有限公司。 牛血清白蛋白(>96%)購自上海生工生物科技有限公司。 本研究中使用的其他化學(xué)品購自北京化學(xué)試劑有限公司。 所有光譜研究均在10 mmol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中進行, 實驗使用(Millipore, 18.2 MΩ·cm)超純水。

穩(wěn)態(tài)光譜實驗在UV-2450光譜儀(Shimadzu Corporation)和FS5熒光光譜儀(Edinburgh Instruments)上進行。 瞬態(tài)熒光(時間分辨熒光)光譜實驗在Tempro-01光譜儀(Horiba Jobin Yvon)上完成, 使用NanoLED為激發(fā)光源及時間相關(guān)單光子計數(shù)檢測技術(shù)。 熒光壽命的擬合使用瞬態(tài)熒光光譜儀Tempro-01配套的數(shù)據(jù)擬合軟件DAS6, 采用的是重卷積分(reconvolution)處理模式, 衰減函數(shù)i(t)用燈譜函數(shù)P(t)去卷積分處理, 然后與實際測得的衰減曲線F(t)比較給出擬合系數(shù)χ2。 經(jīng)過對F′(t)不斷地重復(fù)計算直至找到最佳的擬合情況及最小的擬合系數(shù)為止, 通過擬合系數(shù)χ2值和加權(quán)殘差的隨機性來判斷擬合質(zhì)量。 在單指數(shù)模型不足以描述測量的衰變的情況下, 使用多指數(shù)模型來擬合衰變, 所用公式為

(1)

式(1)中,F是熒光強度,Ai是描述激發(fā)物種比率的每個分量的相對振幅,τi表示它們的壽命。

研究中, 采用分子對接模擬(molecular docking simulation)方法[13-14]通過空間匹配和能量匹配模擬凝血酶和DAB的相互識別和結(jié)合過程, 分析并解釋光譜實驗結(jié)果。 模擬時, 凝血酶(PDB ID： 1KTS)的結(jié)構(gòu)來源于RCSB Protein Data Bank[15]。 DAB及其衍生物首先在Gaussian16軟件[16]中采用密度泛函理論B3LYP/6-31G*方法進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化, 然后將分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6中進行分子的電荷分布計算、 設(shè)置分子可旋轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵等預(yù)處理[17]; 使用AutoDock Vina程序[18]預(yù)測凝血酶和DAB的結(jié)合構(gòu)象和結(jié)合親和力; 最終, 采用BIOVIA Discovery Studio Visualizer軟件進行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 達比加群DAB對凝血酶的熒光猝滅

DAB為極性分子, 其pKa1=4.24, pKa2=11.51[12], 在pH 7.4磷酸緩沖溶液中以兩性離子形式存在。 DAB吸收峰位于300 nm處[圖2(a)], 在390 nm有微弱的熒光發(fā)射。 當(dāng)DAB的極性基團在DE中轉(zhuǎn)化為酯時, DE的吸收光譜為290～320 nm的寬峰, 熒光強度略有增強并紅移至410 nm[圖2(b)]。 相比之下, 凝血酶在280 nm激發(fā)時, 在330 nm處具有很強的熒光。

圖2 凝血酶、 達比加群、 達比加群酯在pH 7.4磷酸緩沖溶液中的(a)吸收光譜和(b)熒光光譜

當(dāng)DAB與凝血酶相互作用時, 凝血酶330 nm的熒光強度減弱, 并且隨著DAB的濃度增加, 凝血酶的熒光猝滅更多, 直至DAB濃度達到3 μmol·L-1時趨近飽和[圖3(a)]。 此時, 穩(wěn)態(tài)熒光呈現(xiàn)明顯的雙峰, 峰值分別在330和375 nm。 凝血酶+DAB混合樣品的時間分辨熒光光譜顯示, 隨著DAB濃度的增加, 330 nm熒光的壽命逐漸變短, 當(dāng)DAB濃度達到3 μmol·L-1后不再繼續(xù)改變[圖3(b)]。 指數(shù)衰減分析表明(表1), 凝血酶本身在330 nm處的熒光由兩個壽命成分組成τ1=5.55 ns和τ2=2.26 ns。 當(dāng)DAB與凝血酶相互作用時, 出現(xiàn)了第三個短壽命組分(τ3～700 ps), 并且τ3組分的占比隨著DAB濃度的增加而增加。 由于游離的DAB熒光微弱并且熒光壽命短于儀器的檢測極限(～50 ps), 可以推測混合物中的τ3組分來自一個新物質(zhì), 即凝血酶-DAB復(fù)合物。

表1 凝血酶(100 U·mL-1)以及凝血酶+DAB混合樣品在330 nm的熒光壽命(激發(fā)波長為280 nm)

圖3 凝血酶與不同濃度達比加群混合樣品的穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜(λex=280 nm, 瞬態(tài)熒光檢測波長λem=330 nm)

不同濃度DAB和凝血酶混合樣品的Stern-Volmer圖顯示(圖4), 在DAB低濃度范圍內(nèi)(0.5～3 μmol·L-1), 凝血酶的熒光被快速猝滅并且熒光強度和熒光壽命的變化相同, 表現(xiàn)出動態(tài)猝滅的特征。 當(dāng)DAB的濃度達到3 μmol·L-1以上時, 混合樣品在330 nm的熒光壽命不會進一步改變, 但是仍然可以觀察到一個較慢的熒光強度猝滅, 此時DAB對凝血酶的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。 實驗現(xiàn)象表明, DAB與凝血酶能夠在低濃度時快速結(jié)合, 有效形成凝血酶-DAB復(fù)合物。 由于凝血酶分子在溶液中高度極化[12, 19-21], 其機制很可能是由于兩者之間的靜電相互作用。

圖4 達比加群和達比加群酯對凝血酶熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.2 達比加群酯DE對凝血酶熒光光譜的影響

當(dāng)DE與凝血酶相互作用時, 凝血酶330nm的熒光強度隨著DE濃度的增大緩慢下降[圖5(a)]; 同時, 在400 nm處出現(xiàn)一個新的熒光發(fā)射峰。 當(dāng)在310 nm激發(fā)凝血酶+DE的混合樣品時, 400 nm熒光峰強度更高(圖6)。 另一方面, 單獨的凝血酶在310 nm處不能被激發(fā), 游離的DE在310 nm激發(fā)時的熒光強度遠遠低于混合樣品(圖6)。 因此, 混合樣品中400 nm的熒光必然來自一種新的成分, 即凝血酶和DE之間形成的復(fù)合物。 以310 nm激發(fā)凝血酶-DE復(fù)合物, 測定其在400 nm處熒光為單一短壽命～440 ps。

圖5 凝血酶與不同濃度達比加群酯作用時的穩(wěn)態(tài)(a)和瞬態(tài)(b)熒光光譜(λex=280 nm, 瞬態(tài)熒光檢測波長λem=330 nm)

圖6 分別在280和310 nm激發(fā)凝血酶、 達比加群酯、 凝血酶+達比加群酯混合樣品的熒光光譜

凝血酶+DE混合樣品在330 nm處的時間分辨熒光光譜[圖5(b)]顯示, 盡管凝血酶的熒光強度隨著DE濃度的增加而降低, 但熒光壽命沒有改變, 可見DE對凝血酶的猝滅是單純的靜態(tài)猝滅。 凝血酶+DE的Stern-Volmer圖(圖4)表明凝血酶+DE混合樣品的熒光壽命保持恒定、 而熒光強度和DE濃度之間呈線性關(guān)系, 證實了DE對凝血酶的熒光猝滅是一種靜態(tài)猝滅。

DE是DAB極性基團酯化后的產(chǎn)物, 兩者的主要區(qū)別是電負(fù)性不同。 在pH 7.4緩沖溶液中, DAB為兩性離子, 其苯甲脒基帶正電荷、 羧基帶負(fù)電荷; DE是一個微弱堿性物質(zhì), 在pH 7.4緩沖溶液中主要以中性形式存在。 DAB和DE對凝血酶熒光不同猝滅現(xiàn)象的實驗結(jié)果支持我們關(guān)于DAB與凝血酶相互作用機理的推測, 即： DAB極性基團與溶液中高度極化的凝血酶分子之間的靜電相互作用是DAB和凝血酶快速有效結(jié)合的關(guān)鍵動力學(xué)因素。

2.3 羧酸酯化后達比加群苯甲脒基的作用研究

如果只將DAB的羧酸基團酯化可得到達比加群乙酯(Dabigatran ethyl ester, DAE)。 穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜的研究發(fā)現(xiàn), DAE與DAB對凝血酶熒光的猝滅現(xiàn)象非常接近, 即： 在低濃度時, DAE對凝血酶熒光表現(xiàn)快速的動態(tài)猝滅; 濃度大于3 μmol·L-1時, 熒光壽命不再改變, 只有靜態(tài)猝滅(圖7)。 這一實驗現(xiàn)象說明： DAB的苯甲脒基團是主導(dǎo)藥物與凝血酶有效結(jié)合的動力學(xué)因素, 羧酸基團的影響很小。 在pH 7.4條件下, DAE的苯甲脒基帶正電荷, 凝血酶帶負(fù)電荷[21], DAE對凝血酶的光譜研究進一步證實溶液中DAB與凝血酶分子間的靜電引力是兩者有效結(jié)合的動力學(xué)驅(qū)動。

圖7 達比加群乙酯與達比加群對凝血酶穩(wěn)態(tài)(a)和瞬態(tài)(b)熒光光譜影響的比較(λex=280 nm, 瞬態(tài)熒光檢測波長λem=330 nm)

由于未能獲得達比加群苯甲脒基團單一酯化的產(chǎn)物達比加群己酯(Dabigatran hexyl ester, DAH), 我們通過分子對接模擬方法對上述實驗結(jié)論進一步驗證。

2.4 達比加群及其衍生物與凝血酶結(jié)合的分子對接模擬

凝血酶屬于血漿絲氨酸蛋白酶, 通過利用表面特征的活性位點裂縫和纖維蛋白原識別位點實現(xiàn)多重功能[21-23]。 活性位點區(qū)域包括三個不同的口袋[22]： 特異性口袋S1, 近端疏水口袋S2, 和遠端疏水口袋S3。 特異性口袋S1的底部有酸性氨基酸天冬氨酸殘基Asp189, 使得凝血酶活性口袋在溶液中富含負(fù)電性, 偏好具有堿性殘基的底物[21-23]。 活性位點狹縫被Tyr60A-Pro60B-Pro60C-Trp60D環(huán)(60插入環(huán))封閉, 該序列為凝血酶特有且呈現(xiàn)相對剛性。 該環(huán)在活性位點處形成了一個疏水性的“蓋子”, 限制分子進入, 增強了凝血酶的底物特異性[23]。 DAB通過阻斷活性部位的通路實現(xiàn)對凝血酶的抑制作用。 在分子對接模擬過程中, DAB能夠自發(fā)對接到凝血酶的活性口袋, 表明DAB的結(jié)構(gòu)具有非常強的凝血酶底物適配性。 如圖8所示, 達比加群的中心骨架1,2,5-三取代的苯并咪唑環(huán)恰好能夠“平躺”進入主要由Leu99、 His57、 Tyr60A、 Trp60D殘基側(cè)鏈構(gòu)成的S2口袋中; 苯并咪唑上的取代基向兩側(cè)“舒展”, 苯甲脒基團伸入S1特異性口袋, 與S1口袋底部的天冬氨酸Asp189形成氫鍵; 吡啶環(huán)伸入疏水口袋S3, 羧酸基團與凝血酶分子沒有明確的相互作用。

圖8 達比加群與凝血酶的分子對接

當(dāng)僅有羧基酯化時, DAE[圖9(c)]與DAB[圖9(a)]的構(gòu)象在結(jié)構(gòu)中心苯并咪唑環(huán)、 苯甲脒部分、 吡啶環(huán)部分基本一致; 但乙酯連接在手性N原子上的支鏈發(fā)生扭轉(zhuǎn), 從而導(dǎo)致乙酯鏈向凝血酶外延伸。 這說明缺乏羧基極性不會從根本上影響達比加群與凝血酶的特異性結(jié)合。 但比較DAE(-9.1 kcal·mol-1)和DAB(-9.8 kcal·mol-1)與凝血酶結(jié)合的Gibbs自由能變化(表2), DAB與凝血酶的結(jié)合更穩(wěn)定。

表2 達比加群及其酯化衍生物與凝血酶的結(jié)合能

圖9 達比加群DAB及其極性基團酯化后的衍生物與凝血酶的分子對接構(gòu)象

當(dāng)脒基酯化時, DAH[圖9(b)]與凝血酶的對接構(gòu)象和DAB相比發(fā)生很大改變, 兩者的結(jié)合自由能也相差較大。 沒有苯甲脒基與凝血酶Asp189殘基之間的氫鍵作用, 更大體積的苯甲脒己酯導(dǎo)致分子不能很好的嵌入凝血酶的活性位點, DAH的苯并咪唑環(huán)在凝血酶活性位點的構(gòu)象左右翻轉(zhuǎn), 苯甲脒己酯朝向凝血酶外側(cè)。 這說明脒基的酯化直接影響藥物分子與凝血酶的特異性結(jié)合, 分子對接的結(jié)果驗證了光譜實驗的結(jié)論。

當(dāng)DAB的兩個極性基團都被酯化時, 與DAH類似, DE分子的中心結(jié)構(gòu)苯并咪唑環(huán)沒有能夠恰好“卡”進凝血酶活性位點處的S2口袋內(nèi)[圖9(d)], 體積更大的苯甲脒己酯朝向凝血酶外側(cè)。 分子對接的結(jié)果表明, 中心結(jié)構(gòu)苯并咪唑與凝血酶間的疏水作用雖然能將DE定位到凝血酶的活性部位, 但由于沒有苯甲脒基與S1口袋中酸性氨基酸殘基的靜電引導(dǎo)作用, 有效結(jié)合能力大大減弱。 DE與凝血酶結(jié)合的ΔG僅為-6.9 kcal·mol-1, 與DAB的-9.8 kcal·mol-1相差較大。

表2列出了DAB及其極性基團被酯化的三種衍生物DAE、 DAH、 DE與凝血酶分子對接的結(jié)合能, 對比它們與凝血酶結(jié)合時的分子構(gòu)象, 結(jié)合熒光光譜的實驗結(jié)果分析, 可以得出： 苯甲脒基在DAB與凝血酶特異性結(jié)合過程中起到引導(dǎo)藥物分子以正確構(gòu)象進入凝血酶活性口袋的作用; 疏水作用的結(jié)合是非特異性結(jié)合。

2.5 達比加群和達比加群酯對牛血清白蛋白熒光光譜的影響

在DAB和DE與牛血清白蛋白BSA相互作用的對比實驗中(圖10), 觀察到了DAB對BSA熒光強度的微弱靜態(tài)猝滅, 但沒有觀察到熒光壽命的變化, 即不存在動態(tài)猝滅現(xiàn)象; DAB極性基團酯化后的DE對BSA的熒光猝滅也是單一的靜態(tài)猝滅作用。 熒光光譜的實驗結(jié)果顯示DAB和DE與BSA之間的結(jié)合是非特異性結(jié)合。 在研究過程中, 我們也對比了DAB和DE對人血清白蛋白(HSA)熒光光譜的影響, 得到了和BSA基本一致的結(jié)果。 Simone等在DAB與HSA相互作用的研究中也觀察到了與本實驗結(jié)果相符的現(xiàn)象[9, 24]。

圖10 達比加群和達比加群酯對牛血清白蛋白熒光光譜的影響

此外, 在與BSA作用的熒光光譜實驗中, DAB對BSA熒光強度的猝滅弱于DE, 即DAB和BSA的結(jié)合能力比其極性基團酯化后的DE更弱[圖10(a, c)]。 Naik等[10]在DAB與HSA相互作用的研究中曾推測： 羧基可以增加DAB的親水性, 從而減少DAB與血漿中其他蛋白的疏水性非特異結(jié)合。 這一推測與我們在DAB和DE與BSA相互作用的熒光實驗中觀察到的現(xiàn)象一致。 然而, DAB和DAE與凝血酶相互作用的熒光光譜研究結(jié)果(圖7)也顯示, 在pH 7.4的磷酸緩沖溶液中, 羧基的引入在一定程度上減弱了DAB與凝血酶的結(jié)合。 如何修飾或改變羧酸基團以提高達比加群與凝血酶的結(jié)合能力以及藥物的生理活性還有待進一步探索。

3 結(jié) 論

利用穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜方法研究了DAB與凝血酶在溶液中的相互作用, 研究發(fā)現(xiàn)： DAB對凝血酶的熒光既有動態(tài)猝滅也有靜態(tài)猝滅, 而DAB的極性基團酯化后對凝血酶的熒光只有靜態(tài)猝滅。 通過分析DAB及其酯化產(chǎn)物在凝血酶活性位點的構(gòu)象和結(jié)合能, 提出DAB抑制凝血酶活性的機理為： DAB的苯甲脒基團與凝血酶之間的靜電導(dǎo)向作用是兩者形成有效復(fù)合物的關(guān)鍵驅(qū)動, 疏水作用和苯并咪唑的分子骨架與凝血酶活性位點的空間適配度是兩者穩(wěn)定結(jié)合的基礎(chǔ), 羧酸基團的取向?qū)τ趦烧呓Y(jié)合的穩(wěn)定性有重要的輔助作用。 研究結(jié)果為口服抗凝藥達比加群的臨床應(yīng)用和逆轉(zhuǎn)劑的研究提供了理論和實驗基礎(chǔ)。