賈富鑫, 郭彩茹, 劉萌萌, 劉江偉, 任國(guó)印

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,病死率居所有腫瘤的前5位[1],手術(shù)治療是患者獲得治愈機(jī)會(huì)的唯一方式[2-3]。但由于胰腺和周圍器官及血管關(guān)系密切,腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,大部分胰腺癌在明確診斷時(shí)已喪失手術(shù)切除的時(shí)機(jī)[4-6]。隨著外科技術(shù)的不斷進(jìn)步,腫瘤根治性切除率也在不斷提高,但其診治現(xiàn)狀仍不樂(lè)觀,患者的預(yù)后未得到明顯改善[5]。目前,對(duì)于胰腺癌的篩查和評(píng)估預(yù)后尚缺乏特異度或敏感度較高的生物標(biāo)志物[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的吞噬和運(yùn)動(dòng)蛋白(engulfment and cell mobility,ELMO)3可激活Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物(Ras-related C3 botulinum toxin substrate,RAC)蛋白,進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲生長(zhǎng),參與細(xì)胞骨架重排,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨化遷移和侵襲[8]。有研究發(fā)現(xiàn),ELMO3在一些腫瘤中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。然而,ELMO3在胰腺癌中的表達(dá)水平及臨床意義鮮有研究報(bào)道。本研究檢測(cè)ELMO3在胰腺癌中的表達(dá)水平,以探討其與患者臨床病理指標(biāo)及生存預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2000年1月至2007年12月于新疆軍區(qū)總醫(yī)院(63例)及鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院(65例)經(jīng)胰腺癌切除術(shù)獲得的標(biāo)本128例,另取癌旁(約3 cm)正常胰腺組織標(biāo)本11例作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未接受放、化療及其他治療;(2)無(wú)相關(guān)腫瘤史;(3)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌;(4)癌旁正常胰腺組織經(jīng)病理檢查證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞;(5)臨床及病理資料完整。排除非原發(fā)于胰腺的轉(zhuǎn)移癌及多發(fā)癌。通過(guò)電話、門(mén)診復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪,獲取患者生存預(yù)后信息,隨訪時(shí)間截至2013年12月。本研究獲鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：LWLL-2023-11-17-1)。

1.2主要試劑與設(shè)備 羊抗人多克隆ELMO3抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。全蛋白提取試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。GAPDH抗體、TBST溶液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG H&L、10% SDS-聚丙烯酰胺預(yù)制膠、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。兔二步法染色試劑盒、山羊血清、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑套裝、蘇木素購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PerkinElmer酶標(biāo)儀(型號(hào)：VICTOR X3);Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)印儀(型號(hào)：Bio-Rad Mini Trans-Blot);Bio-Rad電泳儀(型號(hào)：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Systems);熒光顯微鏡(徠卡,型號(hào)：DMI4000B);上海天能凝膠成像儀(型號(hào)：Tanon 5200 Multi)。

1.3Western blot法檢測(cè)ELMO3水平 組織標(biāo)本經(jīng)研磨后應(yīng)用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白,離心后取上清液并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整各組蛋白濃度一致后取相同總量蛋白,然后加入等體積5×蛋白上樣緩沖液,經(jīng)10 min煮沸變性處理。通過(guò)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(80～120 V)分離蛋白,在300 mA條件下將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。室溫下以5%脫脂奶粉液封閉處理PVDF膜1 h后加入一抗液(ELMO3,1∶1 000;GAPDH,1∶4 000),4 ℃孵育過(guò)夜后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次。予二抗液孵育1 h后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次。通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,在凝膠成像儀下進(jìn)行拍照。以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.4免疫組織化學(xué)染色檢查及結(jié)果判斷 嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)PV法染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以石蠟標(biāo)本制作4 μm切片,置于恒溫干燥箱內(nèi)過(guò)夜,經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水、抗原修復(fù),3% H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,置于37 ℃水浴箱內(nèi)孵育10 min,PBS清洗3遍。以非免疫山羊血清封閉非特異性抗原,37 ℃水浴箱內(nèi)孵育10 min。滴加ELMO3抗體稀釋液(1∶100),37 ℃水浴箱內(nèi)孵育2 h,PBS清洗3遍。滴加二抗液,37 ℃水浴箱內(nèi)孵育20 min,PBS清洗3次。DAB顯色液后予蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水及中性樹(shù)膠封片后行鏡下觀察。在200倍鏡下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察,由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立觀片。結(jié)合細(xì)胞染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行綜合評(píng)定,陽(yáng)性細(xì)胞以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分：≤5%,0分;6%～25%,1分;26%～50%,2分;51%～75%,3分;>75%,4分。根據(jù)染色程度計(jì)分：淡黃色,1分;黃色或深黃色,2分;褐色或棕褐色,3分。將每個(gè)組織染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分相乘,乘積>1者判定為陽(yáng)性[11]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料的組間比較采用成組t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,以log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用Cox回歸分析探討影響胰腺癌患者預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胰腺癌組織中的ELMO3表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,胰腺癌組織中ELMO3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,少數(shù)病例出現(xiàn)細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)同時(shí)著色。128例患者的癌組織中ELMO3陽(yáng)性率為83.59%(107/128),而在癌旁正常胰腺組織中ELMO3陽(yáng)性率為27.27%(3/11),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.199,P<0.001),見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,胰腺癌組織ELMO3表達(dá)水平顯著高于癌旁正常胰腺組織(t=1.205,P=0.001),見(jiàn)圖2。

?胰腺癌組織中ELMO3陽(yáng)性表達(dá);?癌旁正常胰腺組織中ELMO3陰性表達(dá)

?Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(C表示胰腺癌組織,N表示癌旁正常胰腺組織);?兩組ELMO3相對(duì)表達(dá)量水平比較

2.2胰腺癌患者ELMO3表達(dá)情況與臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 ELMO3表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤部位及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 胰腺癌患者ELMO3表達(dá)情況與臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

2.3ELMO3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 本組病例隨訪時(shí)間為4～36個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為18個(gè)月,失訪8例(其中ELMO3陽(yáng)性組1例,ELMO3陰性組7例),120例胰腺癌患者獲得隨訪,其中位生存時(shí)間為12個(gè)月,1年累計(jì)生存率為43.3%。ELMO3陽(yáng)性組中位生存時(shí)間短于ELMO3陰性組(11個(gè)月 vs 35個(gè)月)。ELMO3陰性組生存預(yù)后優(yōu)于ELMO3陽(yáng)性組(log-rank檢驗(yàn)：χ2=58.602,P<0.001),見(jiàn)圖3。

圖3 ELMO3陽(yáng)性組和ELMO3陰性組生存曲線圖

2.4影響胰腺癌患者生存預(yù)后的Cox回歸分析結(jié)果

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期和ELMO3表達(dá)情況與患者生存預(yù)后存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。進(jìn)一步的多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,ELMO3陽(yáng)性表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期是胰腺癌患者生存預(yù)后不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 影響胰腺癌患者生存預(yù)后的Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

3.1胰腺癌因早期確診困難、多耐藥性及易轉(zhuǎn)移等因素,患者預(yù)后往往較差[5,12],深入探討胰腺癌的發(fā)病機(jī)理,尋找其致病規(guī)律及關(guān)鍵基因,對(duì)胰腺癌的早期診治和預(yù)后評(píng)估意義重大。另外,術(shù)前新輔助治療作為胰腺癌治療新方向,被證實(shí)可提高患者根治性切除術(shù)后的生存率,有效的腫瘤標(biāo)志物有助于胰腺癌早期檢測(cè)及新輔助治療反應(yīng)評(píng)估,可為患者提供個(gè)性化治療策略并改善腫瘤學(xué)結(jié)局[13]。

3.2研究發(fā)現(xiàn),由主要結(jié)構(gòu)相似的ELMO1、ELMO2和ELMO3組成的ELMO家族廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi),其在細(xì)胞骨架重塑和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)中起重要作用[14-16]。既往研究大多關(guān)注ELMO1和EMLO2的功能,而對(duì)ELMO3的研究較少。近年有研究發(fā)現(xiàn)ELMO3在一些腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。Pan等[17]通過(guò)黏附和跨孔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ELMO3的小干擾RNA可以通過(guò)抑制Lewis肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。Peng等[18]研究發(fā)現(xiàn)敲除ELMO3基因可抑制結(jié)直腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Michaelsen等[10]研究指出,ELMO3在膠質(zhì)瘤的腫瘤侵襲區(qū)域高表達(dá),其在調(diào)控RAC1激活、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,ELMO3可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的直接驅(qū)動(dòng)因素。Kotowski等[19]研究顯示,ELMO3在唾液腺癌組織中高表達(dá),且與患者無(wú)病生存率和疾病復(fù)發(fā)率相關(guān),其可作為評(píng)估患者預(yù)后的指標(biāo)。在乳腺癌患者中亦觀察到ELMO3高表達(dá)與疾病進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)[20]。Hu等[21]認(rèn)為低ELMO3表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和F-肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程,可能為胃癌診斷和評(píng)估預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

3.3目前,關(guān)于ELMO家族與胰腺癌關(guān)系的研究少有報(bào)道,且納入病例數(shù)相對(duì)較少[22-23]。本研究采用免疫組織化學(xué)染色及Western blot法檢測(cè)ELMO3在128例胰腺癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示ELMO3在胰腺癌組織中呈高表達(dá),提示ELMO3可能是胰腺癌的促癌因子。此外,本研究發(fā)現(xiàn)ELMO3與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)性,提示ELMO3可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),這與其在非小細(xì)胞肺癌及大腸癌中的研究結(jié)果一致[18,24]。生存分析結(jié)果顯示,ELMO3陽(yáng)性組中位生存時(shí)間短于ELMO3陰性組,ELMO3陽(yáng)性表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示ELMO3可能是胰腺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的有效分子標(biāo)志物,有助于臨床醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行分層管理,改善預(yù)后。

綜上所述,ELMO3在胰腺癌中呈高表達(dá),其表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期等臨床病理指標(biāo)存在關(guān)聯(lián)。ELMO3可能參與了胰腺癌的惡性演變過(guò)程及侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控,其表達(dá)情況與患者生存預(yù)后相關(guān)。但是,ELMO3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體細(xì)胞功能及分子機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。