賈富鑫, 郭彩茹, 劉萌萌, 劉江偉, 任國印

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,病死率居所有腫瘤的前5位[1],手術治療是患者獲得治愈機會的唯一方式[2-3]。但由于胰腺和周圍器官及血管關系密切,腫瘤細胞易出現(xiàn)局部浸潤和遠端轉移,大部分胰腺癌在明確診斷時已喪失手術切除的時機[4-6]。隨著外科技術的不斷進步,腫瘤根治性切除率也在不斷提高,但其診治現(xiàn)狀仍不樂觀,患者的預后未得到明顯改善[5]。目前,對于胰腺癌的篩查和評估預后尚缺乏特異度或敏感度較高的生物標志物[7]。腫瘤轉移相關的吞噬和運動蛋白(engulfment and cell mobility,ELMO)3可激活Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物(Ras-related C3 botulinum toxin substrate,RAC)蛋白,進而促進肌動蛋白絲生長,參與細胞骨架重排,促進腫瘤細胞趨化遷移和侵襲[8]。有研究發(fā)現(xiàn),ELMO3在一些腫瘤中可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[9-10]。然而,ELMO3在胰腺癌中的表達水平及臨床意義鮮有研究報道。本研究檢測ELMO3在胰腺癌中的表達水平,以探討其與患者臨床病理指標及生存預后的關系,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2000年1月至2007年12月于新疆軍區(qū)總醫(yī)院(63例)及鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院(65例)經胰腺癌切除術獲得的標本128例,另取癌旁(約3 cm)正常胰腺組織標本11例作為對照。納入標準：(1)術前未接受放、化療及其他治療;(2)無相關腫瘤史;(3)經病理學檢查確診為原發(fā)性胰腺導管腺癌;(4)癌旁正常胰腺組織經病理檢查證實無癌細胞;(5)臨床及病理資料完整。排除非原發(fā)于胰腺的轉移癌及多發(fā)癌。通過電話、門診復診等方式進行隨訪,獲取患者生存預后信息,隨訪時間截至2013年12月。本研究獲鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批號：LWLL-2023-11-17-1)。

1.2主要試劑與設備 羊抗人多克隆ELMO3抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。全蛋白提取試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)購自北京索萊寶科技有限公司。GAPDH抗體、TBST溶液、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG H&L、10% SDS-聚丙烯酰胺預制膠、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術股份有限公司。PVDF膜購自Millipore公司。兔二步法染色試劑盒、山羊血清、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑套裝、蘇木素購自北京中杉金橋生物技術有限公司。PerkinElmer酶標儀(型號：VICTOR X3);Bio-Rad蛋白轉印儀(型號：Bio-Rad Mini Trans-Blot);Bio-Rad電泳儀(型號：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Systems);熒光顯微鏡(徠卡,型號：DMI4000B);上海天能凝膠成像儀(型號：Tanon 5200 Multi)。

1.3Western blot法檢測ELMO3水平 組織標本經研磨后應用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白,離心后取上清液并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。調整各組蛋白濃度一致后取相同總量蛋白,然后加入等體積5×蛋白上樣緩沖液,經10 min煮沸變性處理。通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(80～120 V)分離蛋白,在300 mA條件下將蛋白轉印到PVDF膜上。室溫下以5%脫脂奶粉液封閉處理PVDF膜1 h后加入一抗液(ELMO3,1∶1 000;GAPDH,1∶4 000),4 ℃孵育過夜后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次。予二抗液孵育1 h后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次。通過ECL化學發(fā)光法顯影,在凝膠成像儀下進行拍照。以GAPDH為內參,使用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。重復3次獨立實驗。

1.4免疫組織化學染色檢查及結果判斷 嚴格按照免疫組織化學PV法染色試劑盒說明書進行操作。以石蠟標本制作4 μm切片,置于恒溫干燥箱內過夜,經二甲苯和梯度酒精脫蠟至水、抗原修復,3% H2O2去離子水封閉內源性過氧化物酶活性,置于37 ℃水浴箱內孵育10 min,PBS清洗3遍。以非免疫山羊血清封閉非特異性抗原,37 ℃水浴箱內孵育10 min。滴加ELMO3抗體稀釋液(1∶100),37 ℃水浴箱內孵育2 h,PBS清洗3遍。滴加二抗液,37 ℃水浴箱內孵育20 min,PBS清洗3次。DAB顯色液后予蘇木素復染,梯度酒精脫水及中性樹膠封片后行鏡下觀察。在200倍鏡下,每張切片隨機選取5個視野進行觀察,由2位病理科醫(yī)師獨立觀片。結合細胞染色程度和陽性細胞百分率進行綜合評定,陽性細胞以細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為標準。依據(jù)陽性細胞所占比例計分：≤5%,0分;6%～25%,1分;26%～50%,2分;51%～75%,3分;>75%,4分。根據(jù)染色程度計分：淡黃色,1分;黃色或深黃色,2分;褐色或棕褐色,3分。將每個組織染色程度與陽性細胞百分率得分相乘,乘積>1者判定為陽性[11]。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗。計量資料的組間比較采用成組t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,以log-rank檢驗進行組間比較。采用Cox回歸分析探討影響胰腺癌患者預后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1胰腺癌組織中的ELMO3表達情況 免疫組織化學染色結果顯示,胰腺癌組織中ELMO3主要表達于細胞質中,少數(shù)病例出現(xiàn)細胞膜及細胞質同時著色。128例患者的癌組織中ELMO3陽性率為83.59%(107/128),而在癌旁正常胰腺組織中ELMO3陽性率為27.27%(3/11),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.199,P<0.001),見圖1。Western blot檢測結果顯示,胰腺癌組織ELMO3表達水平顯著高于癌旁正常胰腺組織(t=1.205,P=0.001),見圖2。

?胰腺癌組織中ELMO3陽性表達;?癌旁正常胰腺組織中ELMO3陰性表達

?Western blot實驗結果圖(C表示胰腺癌組織,N表示癌旁正常胰腺組織);?兩組ELMO3相對表達量水平比較

2.2胰腺癌患者ELMO3表達情況與臨床病理指標的關聯(lián)性分析結果 ELMO3表達與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結轉移存在顯著關聯(lián)(P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤部位及遠處轉移無顯著關聯(lián)(P>0.05),見表1。

表1 胰腺癌患者ELMO3表達情況與臨床病理指標的關聯(lián)性分析結果

2.3ELMO3表達與患者預后的關系 本組病例隨訪時間為4～36個月,中位隨訪時間為18個月,失訪8例(其中ELMO3陽性組1例,ELMO3陰性組7例),120例胰腺癌患者獲得隨訪,其中位生存時間為12個月,1年累計生存率為43.3%。ELMO3陽性組中位生存時間短于ELMO3陰性組(11個月 vs 35個月)。ELMO3陰性組生存預后優(yōu)于ELMO3陽性組(log-rank檢驗：χ2=58.602,P<0.001),見圖3。

圖3 ELMO3陽性組和ELMO3陰性組生存曲線圖

2.4影響胰腺癌患者生存預后的Cox回歸分析結果

單因素Cox回歸分析結果顯示,腫瘤直徑、遠處轉移、淋巴結轉移、分化程度、TNM分期和ELMO3表達情況與患者生存預后存在顯著關聯(lián)(P<0.05)。進一步的多因素Cox回歸分析結果顯示,ELMO3陽性表達、遠處轉移以及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期是胰腺癌患者生存預后不佳的獨立危險因素(P<0.05),見表2。

表2 影響胰腺癌患者生存預后的Cox回歸分析結果

3 討論

3.1胰腺癌因早期確診困難、多耐藥性及易轉移等因素,患者預后往往較差[5,12],深入探討胰腺癌的發(fā)病機理,尋找其致病規(guī)律及關鍵基因,對胰腺癌的早期診治和預后評估意義重大。另外,術前新輔助治療作為胰腺癌治療新方向,被證實可提高患者根治性切除術后的生存率,有效的腫瘤標志物有助于胰腺癌早期檢測及新輔助治療反應評估,可為患者提供個性化治療策略并改善腫瘤學結局[13]。

3.2研究發(fā)現(xiàn),由主要結構相似的ELMO1、ELMO2和ELMO3組成的ELMO家族廣泛分布于哺乳動物體內,其在細胞骨架重塑和促進腫瘤細胞的運動中起重要作用[14-16]。既往研究大多關注ELMO1和EMLO2的功能,而對ELMO3的研究較少。近年有研究發(fā)現(xiàn)ELMO3在一些腫瘤組織中表達上調。Pan等[17]通過黏附和跨孔實驗發(fā)現(xiàn)ELMO3的小干擾RNA可以通過抑制Lewis肺癌細胞的上皮-間質轉化而抑制細胞的侵襲和遷移。Peng等[18]研究發(fā)現(xiàn)敲除ELMO3基因可抑制結直腸癌發(fā)展和轉移。Michaelsen等[10]研究指出,ELMO3在膠質瘤的腫瘤侵襲區(qū)域高表達,其在調控RAC1激活、促進腫瘤細胞遷移中發(fā)揮關鍵作用。因此,ELMO3可能是腫瘤侵襲轉移的直接驅動因素。Kotowski等[19]研究顯示,ELMO3在唾液腺癌組織中高表達,且與患者無病生存率和疾病復發(fā)率相關,其可作為評估患者預后的指標。在乳腺癌患者中亦觀察到ELMO3高表達與疾病進展及不良預后有關[20]。Hu等[21]認為低ELMO3表達可顯著抑制細胞的增殖、侵襲轉移、細胞周期調節(jié)和F-肌動蛋白聚合過程,可能為胃癌診斷和評估預后的潛在分子標志物。

3.3目前,關于ELMO家族與胰腺癌關系的研究少有報道,且納入病例數(shù)相對較少[22-23]。本研究采用免疫組織化學染色及Western blot法檢測ELMO3在128例胰腺癌組織中的表達情況,結果顯示ELMO3在胰腺癌組織中呈高表達,提示ELMO3可能是胰腺癌的促癌因子。此外,本研究發(fā)現(xiàn)ELMO3與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結轉移存在關聯(lián)性,提示ELMO3可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關,這與其在非小細胞肺癌及大腸癌中的研究結果一致[18,24]。生存分析結果顯示,ELMO3陽性組中位生存時間短于ELMO3陰性組,ELMO3陽性表達是胰腺癌患者預后不佳的獨立危險因素,提示ELMO3可能是胰腺癌早期診斷和預后評估的有效分子標志物,有助于臨床醫(yī)師對患者進行分層管理,改善預后。

綜上所述,ELMO3在胰腺癌中呈高表達,其表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移、分化程度及TNM分期等臨床病理指標存在關聯(lián)。ELMO3可能參與了胰腺癌的惡性演變過程及侵襲轉移調控,其表達情況與患者生存預后相關。但是,ELMO3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體細胞功能及分子機制仍待進一步探討。