周宇 曹欽鈺 劉蕾

(遵義市第一人民醫(yī)院泌尿外科,貴州 遵義 563000)

腎癌是我國常見的一種惡性腫瘤,且呈逐年上升趨勢,已嚴重威脅患者生命安全〔1,2〕。目前研究發(fā)現(xiàn),麻醉可影響腎癌等腫瘤手術患者遠期預后,患者外周血液中腫瘤細胞數(shù)量與患者生存及預后密切相關,表明靜脈麻醉藥對腎癌等腫瘤細胞生長及轉移具有重要作用〔3〕。長鏈非編碼(Lnc)RNA屬于內源性非編碼RNA分子,其富含微小(mi)RNA的結合位點,并可通過充當miRNA的競爭性內源(ce)RNA而正向調控靶基因表達從而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔4〕。但LncRNA是否可作為靜脈麻醉藥調節(jié)腎癌細胞生物學行為的潛在靶點尚未明確。咪達唑侖是常用的一種靜脈麻醉藥,其具有良好的鎮(zhèn)靜效果,研究表明,咪達唑侖可促進肺腺癌細胞凋亡,并可抑制肺腺癌移植瘤生長〔5〕。但咪達唑侖對腎癌細胞生物學行為的影響尚未明確。研究表明,下調LncRNA核受體亞家族2組F成員反義RNA(NR2F2-AS)1表達可抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導細胞凋亡〔6〕。但LncRNA核受體亞家族2組F成員反義RNA(NR2F2-AS)1在腎癌細胞生長及轉移過程中的作用機制尚未闡明。本研究探討咪達唑侖通過調控LncRNA NR2F2-AS1表達對腎癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 咪達唑侖(上海甄準生物科技有限公司,規(guī)格：10 mg);人腎癌細胞786-O(美國ATCC);反轉錄與熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化);si-NC、si-NR2F2-AS1(廣州銳博生物);pcDNA、pcDNA-si-NR2F2-AS1(上海吉滿生物);CCK-8試劑、細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Transwell小室(美國Corning);兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(美國CST);內參GAPDH與山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)/IgG二抗(美國Santa Cruz)。

1.2實驗分組 在6孔板每孔中接種對數(shù)生長期786-O細胞1×104個,加入含有不同濃度(0、20、40、60 μmol/L)咪達唑侖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h〔7〕,分別記為0、20、40、60 μmol/L組。將si-NC、si-NR2F2-AS1分別轉染至786-O細胞,分別記為si-NC組、si-NR2F2-AS1組。參照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書將pcDNA、pcDNA-NR2F2-AS1分別轉染至786-O細胞,轉染成功后加入含有濃度為60 μmol/L咪達唑侖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為咪達唑侖+pcDNA組、咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組。

1.3CCK-8實驗檢測細胞增殖 將1.2中所有組別的786-O細胞1×103個接種于96孔板每孔,與10 μl CCK-8溶液反應2 h,在450 nm處,應用酶標儀測定吸光度(A)值。抑制率(%)=(1-A實驗/A對照)×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 將1.2中所有組別的786-O細胞加入胰蛋白酶消化后經3 000 r/min轉速離心5 min,棄上清后用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,加入400 μl結合緩沖液懸浮細胞后分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI),將上述處理后的細胞進行避光放置,放置15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。使用Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Solarbio,北京)進行細胞凋亡測定。 首先,收集細胞并用 1×結合緩沖液洗滌2次,然后用1×結合緩沖液重懸,最終濃度為 1×106個/ml。 接下來,將 5 μl Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μl PI溶液加入100 μl細胞懸液中,室溫避光培養(yǎng)15 min。 最后,通過 FACScan 流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,美國)檢測樣品。

1.5Transwell實驗檢測細胞遷移 將1.2中所有組別的786-O細胞(1×105個/孔)接種于上室,然后將600 μl培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)加入小室,48 h后將500 μl 4%多聚甲醛加入小室中固定細胞20 min,隨后用1%結晶紫染色液染色10 min,最后使用顯微鏡觀察遷移細胞數(shù)。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA NR2F2-AS1的表達水平 取1 ml Trizol試劑提取786-O細胞總RNA。RNA反轉錄合成cDNA,cDNA加入20倍焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋后進行RT-qPCR擴增,熱循環(huán)條件：95 ℃預變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。應用ABI StepOnePlus RT-qPCR儀檢測LncRNA NR2F2-AS1相對表達量。

1.7Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量 用400 μl RIPA裂解液提取1.2中所有組別的786-O細胞的總蛋白。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后蛋白樣品,轉膜并用5%脫脂奶粉在室溫下放置2 h。分別將兔抗人Bax(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2(1∶1 000)一抗與內參GAPDH抗體(1：3000)稀釋液添加到膜中,4 ℃孵育24 h,將山羊抗兔HRP/IgG二抗稀釋液(1∶5 000)加入膜中并在室溫孵育1 h,成像后,ImageJ軟件用于各條帶灰度值測量。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1咪達唑侖對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移的影響 與咪達唑侖0 μmol/L組比較,咪達唑侖20、40、60 μmol/L組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明顯升高,遷移細胞數(shù)和Bcl-2蛋白水平明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表1、圖2。

表1 咪達唑侖及抑制LncRNA NR2F2-AS1對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移和對咪達唑侖處理的腎癌786-O細胞增殖、遷移的影響及細胞中LncRNA NR2F2-AS1表達

圖1 各組細胞凋亡

1～8：咪達唑侖0、20、40、60 μmol/L組、si-NC組、si-NR2F2-AS1組、咪達唑侖+pcDNA組、咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組圖2 Western印跡檢測各組凋亡蛋白表達

2.2咪達唑侖對腎癌786-O細胞中LncRNA NR2F2-AS1表達的影響 與咪達唑侖0 μmol/L組比較,咪達唑侖20、40、60 μmol/L組LncRNA NR2F2-AS1的表達量明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

2.3LncRNA NR2F2-AS1轉染效率的檢測 與si-NC組(1.00±0.00)比較,si-NR2F2-AS1組LncRNA NR2F2-AS1表達量(0.37±0.03)明顯降低(t=36.373,P=0.000);與咪達唑侖+pcDNA組(1.00±0.00)比較,咪達唑侖+pcDNA-si-NR2F2-AS1組LncRNA NR2F2-AS1表達量(2.85±0.21)明顯升高(t=15.259,P=0.000)。

2.4抑制LncRNA NR2F2-AS1對腎癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移的影響 與si-NC組比較,si-NR2F2-AS1組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明顯升高,遷移細胞數(shù)和Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05),見圖1、表1、圖2。

2.5LncRNA NR2F2-AS1對咪達唑侖處理的腎癌786-O細胞增殖、遷移、凋亡的影響 與咪達唑侖+pcDNA組比較,咪達唑侖+pcDNA-NR2F2-AS1組細胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白表達明顯降低,遷移細胞數(shù)、Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05),見表1。

3 討 論

LncRNA在腎癌組織和細胞系中表達異常,并可通過調節(jié)miRNA/mRNA表達而參與腎癌細胞生長及轉移過程,還可能作為腎癌靶向治療的潛在靶點〔8～10〕。咪達唑侖可抑制神經膠質瘤和肺癌細胞增殖〔11〕。咪達唑侖可通過促進miR-137表達而抑制胃癌細胞增殖及促進細胞凋亡〔12〕。咪達唑侖通過下調轉錄共激活因子p300表達而抑制人頭頸部鱗癌細胞增殖〔13〕。本研究結果提示,咪達唑侖可抑制腎癌細胞增殖及遷移。Bax屬于促凋亡蛋白,Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,當細胞接收凋亡信號時Bax表達上調而Bcl-2表達下調進而促進細胞凋亡〔14〕。本研究結果提示,咪達唑侖可促進腎癌細胞凋亡。LncRNA NR2F2-AS1在非小細胞肺癌細胞中高表達,其促非小細胞肺癌細胞增殖及促轉移的作用機制與通過充當miR-320b的ceRNA分子而促進整合位點基因(BMI1)表達有關〔15〕。沉默LncRNA NR2F2-AS1可誘導結直腸癌細胞周期阻滯及細胞增殖〔16〕。LncRNA NR2F2-AS1可促進透明細胞腎細胞癌細胞生長〔17〕。本研究結果提示,咪達唑侖可能通過下調LncRNA NR2F2-AS1的表達而影響腎癌細胞生物學行為。同時,咪達唑侖可通過抑制LncRNA NR2F2-AS1表達而抑制腎癌細胞生長及轉移,并可誘導細胞凋亡。

綜上,咪達唑侖可通過抑制LncRNA NR2F2-AS1表達而抑制腎癌細胞增殖及遷移,并可促進腎癌細胞凋亡,LncRNA NR2F2-AS1可能作為咪達唑侖影響腎癌細胞生物學行為的潛在靶點。但咪達唑侖調節(jié)腎癌細胞生物學行為的具體作用機制仍需進一步探究。