張曦萌 魏灃 韓效愈

(天津市口腔醫(yī)院河西分診部,天津 河西 300061)

絕經(jīng)后女性雌激素分泌減少,此時(shí)骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,一項(xiàng)動物試驗(yàn)報(bào)道〔1〕表明,雌激素缺乏可致牙槽骨骨單位破壞,最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。以往臨床上多以外源性給予激素為主要治療方式,認(rèn)為激素干預(yù)可明顯促進(jìn)骨重建,促進(jìn)成骨分化,研究發(fā)現(xiàn),人生長激素可促進(jìn)骨組織生長〔2,3〕。雖然目前臨床上已有研究認(rèn)為人生長激素具有促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化作用,但并未明確其發(fā)揮作用的具體機(jī)制〔4〕。本研究分析不同劑量人生長激素對卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取20只SPF清潔級3月齡雌性SD大鼠,體質(zhì)量250～300 g,由中科檢測技術(shù)服務(wù)(廣州)股份有限公司提供,動物許可證號：SYXK(粵)2021-0260,22～28 ℃、相對濕度為50%～60%的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)7 d,飼養(yǎng)過程中自由活動、進(jìn)食,明暗周期為12 h。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑及儀器：磷酸鹽緩沖液(北京伊塔生物科技有限公司);兔抗人細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2抗體〔愛必信(上海)生物科技有限公司〕;小鼠抗大鼠Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2抗體(深圳海思安生物技術(shù)有限公司)。流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特);倒置顯微鏡(賽默飛世爾科技);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)。

1.2卵巢去勢模型構(gòu)建 20只大鼠中選取10只為正常組,不做任何處理,其余10只為卵巢去勢組,均腹腔注射10%水合氯醛,完整摘除雙側(cè)卵巢,建立卵巢去勢模型。卵巢去勢3個月后觀察兩組體質(zhì)量、血清鈣(Ca2+)、雌二醇(E2)水平、股骨骨密度(BMD),并隨機(jī)選取兩組中5只,做脛骨組織蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察脛骨組織變化。與正常組比較,卵巢去勢組體質(zhì)量升高,Ca2+、E2、BMD降低,脛骨組織病理改變則說明卵巢去勢模型構(gòu)建成功。

1.3卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞分離培養(yǎng) 將卵巢去勢組使用戊巴比妥鈉麻醉,消毒口腔,取上下頜磨牙,刮取牙周膜組織,制備組織塊(大小為1 mm3),使用不含胎牛血清的α-基礎(chǔ)伊格爾培養(yǎng)基(MEM)、磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗,清洗完畢接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi),加DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%雙抗),37 ℃下培養(yǎng),培養(yǎng)液每2 d換1次,當(dāng)細(xì)胞生長至80%時(shí)傳代,培養(yǎng)至第3代。

1.4卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞鑒定 取第3代牙周膜干細(xì)胞,制備為單細(xì)胞懸液,將單細(xì)胞懸液、CD146單抗、基質(zhì)細(xì)胞抗原(STRO)-1單抗加入至流式管中,混合均勻,避光環(huán)境下孵育1 h,之后洗滌細(xì)胞,加入二抗免疫球蛋白標(biāo)記的異硫氰酸熒光素(Ig-FITC),避光45 min,之后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞分組培養(yǎng) 將鑒定完成的牙周膜干細(xì)胞,以3×104/ml濃度的細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板上,24 h后去除未貼壁的細(xì)胞,分為空白組、人生長激素組,空白組使用細(xì)胞液做常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),人生長激素組分為10、50、100、150、200 μg/L 5個干預(yù)劑量亞組,分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10、50、100、150、200 μg/L劑量的人生長激素,培養(yǎng)3 d觀察其變化。

1.6細(xì)胞增殖測定 采用噻唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞增殖能力,將各組細(xì)胞以3×104/ml濃度的細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板上,對細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的培養(yǎng),在各個時(shí)間點(diǎn)加入10 μl MTT試劑,觀察細(xì)胞增殖情況,增殖率=〔細(xì)胞組光密度(OD)值/參照組OD值〕×100%。

1.7成骨分化測定 對細(xì)胞做茜素紅染色,觀察各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況,結(jié)節(jié)形成越多說明成骨分化能力越強(qiáng)。

1.8成骨相關(guān)基因測定 提取各組細(xì)胞RNA,對所提取RNA的純度進(jìn)行測定,當(dāng)純度為1.8～2.1內(nèi)做后續(xù)指標(biāo)檢測,RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以cDNA為模板,使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法測定,反應(yīng)體系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl核苷酸膠體染料,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,72 ℃延伸5 min,共進(jìn)行35個循環(huán),采用2-△△Ct方法計(jì)算出細(xì)胞中骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)表達(dá)量。引物序列：OCN上游引物：5′-CATGAGAGCCCTCACA-3′,下游：5′-AGAGC GACACCCTAGAC-3′;OPN上游引物：5′-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3′,下游：5′-GGTGATGTCCTCG TCTGTA-3′;內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游：5′-GAGGATC TTCATGAGGTAGTCAGT-3′。

1.9細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 沖洗細(xì)胞,加500 μl曲拉通(Triton)X-100(1%)過夜,離心后留存上清液,取50 μl上清液加入至內(nèi)含50 μl顯色底物、50 μl檢測緩沖液的石冠中,使用400～415 nm的吸光度與不同用量標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,測定蛋白濃度后對ALP活性進(jìn)行檢測。ALP活性檢測試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.10Western印跡測定ERK1/2、Runx2信號通路蛋白表達(dá)量 提取細(xì)胞總蛋白,加入RIPA裂解液做超聲裂解,在4 ℃下離心10 min(12 000 r/min)獲得上清液,即為總蛋白提取物,二喹啉甲酸(BCA)測定濃度。測定蛋白提取物濃度后做蛋白變性、蛋白質(zhì)分離,之后將上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,脫脂奶粉對其進(jìn)行封閉處理,加入一抗,過夜,次日TBST洗滌,加入二抗,室溫下孵育,辣根過氧化物酶(HRP)顯色,獲得ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白條帶圖,分析其表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1卵巢去勢模型構(gòu)建驗(yàn)證

2.1.1正常組、卵巢去勢組體質(zhì)量、血清Ca2+、E2、BMD對比 卵巢去勢組體質(zhì)量高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);卵巢去勢組血清Ca2+、E2、BMD低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 正常組、卵巢去勢組體質(zhì)量、血清Ca2+、E2、BMD對比

2.1.2正常組、卵巢去勢組脛骨組織變化 正常組骨小梁結(jié)構(gòu)完整,骨基質(zhì)均勻,骨皮質(zhì)厚,邊緣較光滑,僅有少量骨吸收陷凹。卵巢去勢組骨小梁數(shù)目減少、斷裂,骨基質(zhì)內(nèi)有較多的骨吸收陷凹,骨皮質(zhì)較正常組明顯變薄,邊緣毛糙。見圖1。

圖1 兩組脛骨組織(HE染色,×100)

2.2卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢去勢大鼠磨牙所分離的牙周膜干細(xì)胞見圖2,原代細(xì)胞、第1代細(xì)胞為長梭狀、點(diǎn)狀形態(tài),第3代細(xì)胞出現(xiàn)典型的長梭狀、漩渦狀形態(tài)。

圖2 卵巢去勢大鼠磨牙所分離的牙周膜干細(xì)胞(×100)

2.3卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞鑒定 CD146、STRO-1陽性表達(dá),說明所培養(yǎng)的卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞為間充質(zhì)來源。見圖3。

圖3 卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測

2.4空白組、人生長激素組細(xì)胞增殖率對比 人生長激素組24、48、72 h細(xì)胞增殖率高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著人生長激素組干預(yù)劑量增加,24、48、72 h細(xì)胞增殖率逐漸升高,呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 空白組、人生長激素組細(xì)胞增殖率、成骨相關(guān)基因表達(dá)量、ALP活性對比

2.5空白組、人生長激素組成骨相關(guān)基因表達(dá)量、ALP活性對比 人生長激素組OCN、OPN基因表達(dá)量、ALP活性高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著人生長激素組干預(yù)劑量增加,OCN、OPN基因表達(dá)量、ALP活性逐漸升高,呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.6空白組、人生長激素組細(xì)胞成骨分化能力對比 空白組僅有少量礦化結(jié)節(jié),人生長激素組礦化結(jié)節(jié)增多,且隨著干預(yù)劑量增加礦化結(jié)節(jié)逐漸增多。見圖4。

2.7空白組、人生長激素細(xì)胞ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)量對比 人生長激素組ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白表達(dá)高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著人生長激素組干預(yù)劑量增加ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2表達(dá)量逐漸升高,呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖5。

1～5：空白組、人生長激素10、50、100、150、200 μg/L組圖5 各組ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)

表3 空白組、人生長激素組細(xì)胞ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)量對比

3 討 論

絕經(jīng)后婦女雌激素含量降低,骨質(zhì)疏松發(fā)生率較高,骨質(zhì)疏松可累及機(jī)體多個部位骨組織成骨能力,其中以牙槽骨骨量減少較為常見,在此狀態(tài)下絕經(jīng)后婦女罹患牙周疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯提高。本文結(jié)果提示,卵巢去勢可降低BMD,雌激素降低與牙周組織再生有關(guān),表明高劑量的人生長激素可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化。

人生長激素屬肽類激素,主要由垂體合成分泌,在骨組織生長中具有重要的作用,部分研究發(fā)現(xiàn)〔5〕,生長激素具有骨質(zhì)改建的作用。目前已有報(bào)道顯示,人生長激素具有促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的作用,如朱懷安等〔6〕研究發(fā)現(xiàn),給予骨髓基質(zhì)細(xì)胞150 μg/L的人生長激素培養(yǎng),可明顯促進(jìn)其骨性分化。肖卓等〔7〕認(rèn)為,去勢大鼠接受人重組生長激素干預(yù)后可保護(hù)剩余牙槽骨并增加成骨。另外已有研究報(bào)道〔4〕,人生長激素具有促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的作用。上述研究成果均證實(shí)人生長激素具有促進(jìn)成骨分化的作用,本文結(jié)果提示,人生長激素可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞增殖,其中以200 μg/L濃度效果最為顯著,此結(jié)果與楊俊輝等〔4〕研究結(jié)果一致。

研究認(rèn)為〔8～10〕,細(xì)胞是否成骨分化可根據(jù)以下幾點(diǎn)分析,細(xì)胞形態(tài)改變、成骨相關(guān)基因OCN、OPN表達(dá)量增加、礦化結(jié)節(jié)形成等。ALP在臨床上常作為成骨標(biāo)志,其活性越高說明成骨分化水平越高,多與鈣化結(jié)節(jié)共同評價(jià)成骨分化能力〔11,12〕。OCN、OPN均為骨形成標(biāo)志物,其中OCN經(jīng)翻譯生成羧化骨鈣素進(jìn)而參與骨骼發(fā)育,OPN與中后期成骨分化有關(guān)〔13,14〕。本研究結(jié)果提示,使用高劑量人生長激素培養(yǎng)的細(xì)胞成骨能力增強(qiáng)。細(xì)胞成骨分化過程中多信號通路活性改變,ERK屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,包括多個亞型,其中以ERK1、ERK2研究最為廣泛,兩者均與細(xì)胞增殖、分化能力相關(guān),ERK1/2激活后,下游靶基因表達(dá)改變,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖〔15～17〕。隨著目前臨床上對ERK1/2信號通路的逐漸深入,研究發(fā)現(xiàn),Runx2為此信號通路中較為重要的靶基因,Runx2是否表達(dá)與ERK1/2是否被激活相關(guān),Runx2表達(dá)越高細(xì)胞成骨分化能力越強(qiáng),兩者正相關(guān)〔18〕。有報(bào)道稱〔19～22〕,Runx2可與OPN、OCN等成骨相關(guān)基因特異性結(jié)合,誘導(dǎo)成骨分化。本文結(jié)果提示,人生長激素可能經(jīng)誘導(dǎo)成骨基因表達(dá)、提高ALP活性發(fā)揮作用。

綜上,經(jīng)人生長激素培養(yǎng)的卵巢去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞增殖、成骨分化能力增強(qiáng),高劑量最顯著,其機(jī)制可能與激活ERK1/2-Runx2信號通路有關(guān)。