代宇 范偉

(貴州省人民醫(yī)院肝膽外科,貴州 貴陽 550002)

肝癌的發(fā)生與缺乏微量元素、肝硬化、生活環(huán)境、吸煙、遺傳等因素存在聯(lián)系,其早期臨床癥狀表現(xiàn)為刺痛、腹瀉、腹水、食欲減退、肝大、惡性等。目前臨床多通過免疫治療、抗病毒治療、局部消融、手術(shù)等方法對(duì)肝癌進(jìn)行治療,但其復(fù)發(fā)率仍較高,因此尋找新的治療策略對(duì)肝癌患者預(yù)后具有重要意義〔1～6〕。miR-221在宮頸癌、喉癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá),可參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔7〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)在鼻咽癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌等多種腫瘤中發(fā)揮抗凋亡、促增殖的作用〔8〕。基于此,本文基于PI3K/Akt信號(hào)通路探究下調(diào)miR-221對(duì)肝癌大鼠的干預(yù)效果,為肝癌的診治提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究動(dòng)物 選取43只SPF級(jí)Wistar大鼠,體質(zhì)量160～200 g,由珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2021-0158,所有大鼠在室溫23 ℃、濕度50%的無菌籠子中喂養(yǎng)7 d,本試驗(yàn)操作均參照動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定,且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2miR-221慢病毒載體構(gòu)建 采用GenBanK查找序列,獲得脂蛋白脂肪酶(LPL)基因序列,構(gòu)建miR-221沉默、過表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,由長沙愛科博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,并設(shè)置病毒滴度為1×109TU/ml,測(cè)定慢病毒滴度。

1.3分組與建模 選取10只大鼠作為空白組,其余33只參照王軍等〔9〕建立模型,將0.5 ml/100 g的二乙基亞硝胺注射入大鼠腹腔內(nèi),2次/w,連續(xù)注射4 w,以大鼠出現(xiàn)精神萎靡、被毛蓬松污穢、眼睛無神、拱背等情況為建模成功,最終有30只建模成功,分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各10只。

1.4miR-221轉(zhuǎn)染 上調(diào)組、下調(diào)組分別注射10 μl miR-221過表達(dá)、沉默慢病毒懸液,空白組、模型組注射同劑量的生理鹽水,注射7 d后觀察大鼠變化。

1.5病理學(xué)觀察 miR-221轉(zhuǎn)染后,麻醉后處死大鼠,獲取肝臟組織,進(jìn)行脫水、石蠟包埋處理,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下,對(duì)病理形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.6miR-221轉(zhuǎn)染效率鑒定 實(shí)時(shí)熒光定量法鑒定miR-221轉(zhuǎn)染效率,提取肝臟組織總RNA,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法鑒定miR-221表達(dá)量,使用Primer5.0設(shè)計(jì)引物序列,反應(yīng)體系：20 μl蒸餾水,模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、50 ℃ 2 min,60 ℃ 30 s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán),采用2-△△Ct方法計(jì)算出miR-221的表達(dá)量。

1.7生長因子、血清癌胚抗原(CEA)、血清甲胎蛋白(AFP)水平檢測(cè) 取各組大鼠肝臟組織,放入離心管,將放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、蛋白酶抑制劑加入,以12 000 r/min離心處理10 min,制作組織勻漿,取上層清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、bFGF、CEA、AFP水平,將VEGF、bFGF、CEA、AFP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,倒入EP管,后加入待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品,混勻,后將其倒入空白孔中,室溫下孵育90 min,在孔中加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,后加入50 μl VEGF、bFGF、CEA、AFP抗體,室溫下孵育60 min,加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,加入100 μl SP結(jié)合液,封孔,室溫下孵育45 min,加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,后加入100 μl 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,450 nm、570 nm下測(cè)定吸光度(OD)值。

1.8PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用Western印跡法檢測(cè),將各組大鼠肝臟組織放入離心管,將RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑加入,以12 000 r/min離心處理10 min,制作組織勻漿,取上層清液,使用蛋白質(zhì)定量法對(duì)蛋白濃度測(cè)定,后取相同質(zhì)量蛋白,進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜處理,后采用5%脫脂奶粉進(jìn)行封管處理,放入4 ℃冰箱中,過夜處理,后進(jìn)行清洗。加入PI3K、Akt抗體,孵育2 h,進(jìn)行清洗,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗,室溫下孵育3 h,凝膠成像系統(tǒng)下觀察成像情況,計(jì)算恢復(fù)值,以GAPDH為內(nèi)參,對(duì)蛋白表達(dá)情況分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)及F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)特征比較 如圖1所示,空白組肝細(xì)胞無核分裂、細(xì)胞完整、大小一致;模型組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,部分肝細(xì)胞壞死;上調(diào)組炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重,細(xì)胞核出現(xiàn)增大;下調(diào)組炎性浸潤情況明顯改善,細(xì)胞大小基本恢復(fù)一致。

圖1 各組肝臟組織病理特征(HE染色,×400)

2.2miR-221轉(zhuǎn)染效率鑒定 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組miR-221表達(dá)量上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組miR-221表達(dá)量上升,下調(diào)組miR-221表達(dá)量下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染成功。

表1 各組miR-221轉(zhuǎn)染效率、生長因子、腫瘤標(biāo)志物水平及肝臟組織PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3各組生長因子水平對(duì)比 如表1所示,與空白相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組VEGF、bFGF水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組VEGF、bFGF水平上升,下調(diào)組VEGF、bFGF水平下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組腫瘤標(biāo)志物水平對(duì)比 如表1所示,與空白相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組CEA、AFP水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組CEA、AFP水平上升,下調(diào)組CEA、AFP水平下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組肝臟組織PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 如表1、圖2所示,與空白相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組PI3K、Akt水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組PI3K、Akt水平上升,下調(diào)組PI3K、Akt水平下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 各組PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

研究顯示〔10〕,miR-221可參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、造血過程、病毒防御等過程,在宮頸癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)。在宮頸癌中,miR-221可提高HeLa細(xì)胞的增殖能力,且可使癌細(xì)胞凋亡減少;在甲狀腺癌中,miR-221可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,進(jìn)而促進(jìn)了患者病情的發(fā)展〔11〕。焦文鵬等〔12〕研究發(fā)現(xiàn),miR-221在肝癌中呈高表達(dá),且與不良預(yù)后、腫瘤大小、臨床分期存在密切聯(lián)系。本研究顯示,下調(diào)miR-221后可干預(yù)肝癌大鼠病情的發(fā)展,大鼠炎性浸潤情況明顯改善,細(xì)胞大小基本恢復(fù)一致。其機(jī)制可能為miR-221可使肝癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程啟動(dòng),且可靶向脂聯(lián)素受體(AdipoR)1、植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白(PHF)2,進(jìn)而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的激活及轉(zhuǎn)移,促進(jìn)肝癌患者病情的發(fā)展,因此經(jīng)下調(diào)miR-221干預(yù)后大鼠病情明顯改善〔13〕。

VEGF可通過改善瘤體邊緣細(xì)胞能量代謝、促進(jìn)微血管形成、抑制細(xì)胞凋亡等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,而肝癌的主要典型特征為大量新生血管形成,因此VEGF在肝癌患者中多呈高表達(dá)〔14〕。bFGF作為一種單鏈多聚體,對(duì)多種細(xì)胞的有絲分裂具有促進(jìn)作用,且對(duì)血管生成具有促進(jìn)作用,可參與腫瘤間質(zhì)血管新生、侵襲〔15〕。CEA多由位于泌尿道、胃、呼吸道等空腔臟器腫瘤分泌,在腫瘤狀態(tài)下,可進(jìn)入血、淋巴循環(huán),進(jìn)而導(dǎo)致其水平快速升高〔16〕。AFP主要由肝細(xì)胞、卵黃囊合成,而部分肝外腫瘤、肝細(xì)胞癌、胚胎性腫瘤、卵黃囊腫瘤可重新合成AFP,進(jìn)而導(dǎo)致AFP水平升高〔17〕。本研究表明,抑制miR-221表達(dá),可使新生血管形成受到影響,且可促進(jìn)CEA、AFP腫瘤標(biāo)志物水平的優(yōu)化。

PI3K/Akt是在肝癌、腎癌、膽管癌、喉癌中均呈異常表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)連接橋梁〔18〕。Akt為PI3K/Akt通路重要環(huán)節(jié),在磷酸化后可使PI3K/Akt信號(hào)通路激活,進(jìn)而對(duì)下游相關(guān)基因、旁路信號(hào)分子起到了激活作用,調(diào)控了細(xì)胞遷移、侵襲、增殖、凋亡等過程,同時(shí)激活后的PI3K/Akt可促進(jìn)VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2等因子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤血管的形成、腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移,推動(dòng)了腫瘤患者病情的發(fā)展〔19～21〕。本研究顯示,下調(diào)miR-221可明顯減少新生血管的形成,抑制病情發(fā)展,其可能作用機(jī)制為下調(diào)miR-221可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,作用于新生血管形成過程,進(jìn)而改善了增生,最終抑制肝癌的發(fā)展。

綜上所述,肝癌的發(fā)生可激活PI3K/Akt通路,使機(jī)體內(nèi)VEGF、bFGF、CEA、AFP表達(dá)水平升高,促進(jìn)腫瘤血管的形成,加速疾病的發(fā)展,對(duì)大鼠機(jī)體內(nèi)miR-221表達(dá)量進(jìn)行抑制,可抑制PI3K/Akt通路的激活,促使大鼠的恢復(fù),表明肝癌的發(fā)病機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制有關(guān)。