周擎宇 姜華茂

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧 錦州 121001)

前列腺癌屬于男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其具有發(fā)病率高、起病隱匿等特點(diǎn),治療方式主要為放化療,但其生存率較低,因此對(duì)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行探究對(duì)診斷及治療意義深遠(yuǎn)〔1～7〕。zeste基因增強(qiáng)子同源物(EZH)2在癌癥中上調(diào),與癌癥的發(fā)展關(guān)系密切,研究證實(shí),EZH2在腫瘤患者中過(guò)表達(dá)表示預(yù)后較差,可促進(jìn)乳腺癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞增殖〔8,9〕。EZH2對(duì)腫瘤具有促進(jìn)作用,因此對(duì)于EZH2抑制劑的研究不斷深入。EZHZ甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(GSK126)屬于新型抑制劑,抑制EZH2功能,阻礙甲基化組蛋白H3(H3K27)甲基化,發(fā)揮抗腫瘤的效果〔10〕。EZH2在前列腺癌的進(jìn)展中作用較為重要,但具體作用機(jī)制尚不清晰,基于上述研究背景,本研究對(duì)前列腺癌組織及細(xì)胞中EZH2進(jìn)行檢測(cè),并探討EZH2抑制劑干預(yù)前列腺癌細(xì)胞,對(duì)其增殖、凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 于2018年4月至2020年10月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)診斷確診為前列腺癌患者20例,并進(jìn)行手術(shù)切除得到20例前列腺癌組織標(biāo)本及20例癌旁組織標(biāo)本;年齡42～65歲,平均年齡(52.64±6.97)歲?；颊呔?自愿參與,未接受過(guò)內(nèi)分泌治療、放化療。

1.2儀器、試劑及細(xì)胞培養(yǎng) 將獲得的前列腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本放置于液氮中保存。前列腺正常細(xì)胞RWPE-1及前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145細(xì)胞系均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。主要儀器及試劑盒廠家：GSK126購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz,RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司。正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞、前列腺癌PC-3、LNCaP和DU145細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),融合度70%～80%,胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-3細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml接種96孔培養(yǎng)板,隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組、低、中、高劑量GSK126組,對(duì)照組細(xì)胞不做處理,低、中、高劑量GSK126組細(xì)胞分別應(yīng)用EZH2抑制劑GSK126,溶解于DMSO,稀釋到所需終濃度5、25、50 μmol/L,溶于培養(yǎng)基中,細(xì)胞傳代、換液均加入GSK126,維持7 d后,取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4熒光定量PCR檢測(cè) 取癌組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)染7 d的細(xì)胞,Trizol提取總RNA,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度、純度。獲取cDNA,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);引物序列：EZH2上游引物5′-GTTGGCGGGA AGCGTGTAAAGACT-3′,下游5′-GTATCCTTCGCTGCTTCCATTC-3′,β-actin上游引物5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAG-3′,下游5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′,以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5細(xì)胞增殖 收集干預(yù)后各組PC-3細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,1×105個(gè)/孔接種培養(yǎng)板,常規(guī)培養(yǎng)12、36、72 h后,收集細(xì)胞,5 g/L的MTT溶液20 μl,孵育4 h,棄上清,加二甲基亞砜200 μl,反應(yīng)后,檢測(cè)各組吸光值(OD值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞凋亡 分別取轉(zhuǎn)染7 d后各組PC-3細(xì)胞,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行步驟操作,流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western印跡檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá) Western印跡檢測(cè)Bax、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量,將各組細(xì)胞接種到6孔板,加入細(xì)胞裂解液,裂解細(xì)胞,收集上清液;BCA檢測(cè)蛋白濃度,30 μg蛋白樣品,進(jìn)行電泳,室溫下孵育1 h,加入兔抗Bax、Caspase-3、Bcl-2、P13K、AKT、mTOR及GADPH多克隆抗體溶液4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,第2天室溫孵育二抗,重復(fù)試驗(yàn)3次,分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1EZH2在前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá) 前列腺癌組織EZH2的相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織明顯升高(2.36±0.35 vs 1.02±0.03,t=17.060,P=0.001,n=20)。前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145細(xì)胞和前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞中EZH2表量分別為2.39±0.31、1.87±0.12、2.03±0.16、1.05±0.04。與前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞相比,前列腺癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)水平均上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.340,P<0.001)。在3種前列腺癌細(xì)胞中,PC-3細(xì)胞中EZH2表達(dá)水平顯著高于LNCaP細(xì)胞(n=10,t=4.947,P<0.05)、DU145細(xì)胞(t=7.034,P<0.05)。后續(xù)研究采用PC-3細(xì)胞。

2.2不同劑量EZH2抑制劑GSK126對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響 如表1所示,與對(duì)照組相比,低、中、高劑量GSK126組前列腺癌PC-3細(xì)胞中EZH2的相對(duì)表達(dá)水平均降低,中劑量GSK126組降低較其他兩組更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)?？梢?jiàn)應(yīng)用EZH2抑制劑GSK126后,成功下調(diào)EZH2在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染12、36和72 h后,與對(duì)照組相比,低、中、高劑量GSK126組OD值均升高,中劑量GSK126組降低較其他兩組更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明應(yīng)用EZH2抑制劑GSK126后對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖能力有明顯的抑制作用。

表1 不同劑量EZH2抑制劑GSK126對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3不同劑量EZH2抑制劑GSK126對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 如表1、圖1、圖2所示,與對(duì)照組相比,低、中、高劑量GSK126組凋亡率及凋亡蛋白Bax、Caspase-3均升高,Bcl-2降低,中劑量GSK126組較其他兩組效果更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明應(yīng)用EZH2抑制劑GSK126后可促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡。

圖1 各組PC-3細(xì)胞凋亡(Tunel染色,×200)

2.4PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量 如表2所示,與對(duì)照組相比,低、中、高劑量GSK126組P13K、AKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)均較低,中劑量GSK126組降低較其他兩組效果更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明應(yīng)用EZH2抑制劑GSK126后可抑制PC-3細(xì)胞PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

表2 各組PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

EZH2是屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,其在前列腺癌中可能是通過(guò)調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,高表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖〔11,12〕。EZH2在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)較高時(shí),較多抑癌基因被抑制,提示EZH2屬于抑制因子,抑制轉(zhuǎn)錄〔13〕。本研究結(jié)果顯示,前列腺癌和細(xì)胞中EZH2均呈現(xiàn)高表達(dá),經(jīng)EZH2抑制劑GSK126干預(yù)后,細(xì)胞的增殖抑制,細(xì)胞凋亡增強(qiáng),以中劑量效果較為顯著,EZH2抑制劑GSK126通過(guò)抑制EZH2表達(dá),促進(jìn)抑癌基因表達(dá),進(jìn)而減弱細(xì)胞增殖。

抗凋亡屬于腫瘤治療較為重要,研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡有兩條路徑：內(nèi)源性及外源性凋亡途徑〔14〕。內(nèi)源性凋亡中細(xì)胞色素C釋放較為重要,抗凋亡Bcl-2家族分子和促凋亡分子Bax之間的平衡失調(diào)。Bcl-2家族在內(nèi)源凋亡途徑中,對(duì)線粒體依賴(lài)進(jìn)行調(diào)節(jié)〔15〕。Bax是促凋亡因子,致線粒體膜電位降低,細(xì)胞色素釋放,細(xì)胞凋亡〔16〕。并且上述兩條路徑會(huì)激活Caspase-3。Caspase-3被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者,活化后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17〕。Bax、Caspase-3在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)較低,Bcl-2表達(dá)較高,本研究表明,EZH2抑制劑GSK126可作為治療前列腺癌的潛在藥物靶點(diǎn)。

PI3K-AKT-mTOR通路參與細(xì)胞周期進(jìn)程、通過(guò)AKT調(diào)控凋亡蛋白,從而抑制細(xì)胞凋亡,激活的PI3K-AKT-mTOR通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中作用較為重要〔18〕。研究表明,前列腺癌中PI3K-AKT-mTOR通路處于激活狀態(tài),可促進(jìn)腫瘤增殖,蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的突變可促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路激活,調(diào)節(jié)下游mTOR蛋白,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及功能進(jìn)行調(diào)控〔19〕。研究顯示,EZH2表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān),對(duì)細(xì)胞增殖及周期具有一定的影響力〔20〕。本研究說(shuō)明,EZH2抑制劑GSK126可抑制P13K-AKT-mTOR信號(hào)通路激活,但要注意劑量。mTOR蛋白及其下游相關(guān)蛋白表達(dá)可上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路從而影響前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,PI3K激活后,細(xì)胞增殖,EZH2調(diào)節(jié)AKT的磷酸化進(jìn)而參與前列腺癌發(fā)生進(jìn)展〔21〕。

綜上,EZH2抑制劑GSK126具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中EZH2表達(dá)、細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用,其作用機(jī)制可能與PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路有關(guān),但僅為本文研究結(jié)果,EZH2抑制劑GSK126是否可通過(guò)其他信號(hào)通路途徑調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞EZH2表達(dá)及增殖凋亡并未分析,因此,后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證,充分挖掘EZH2抑制劑GSK126的醫(yī)用價(jià)值,為前列腺癌的研究提供新方向。