史曉梅 劉宏巖 肖鈺雪 王鑫赫 張兆鵬 王松 郭軍鵬

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春 130117)

胃腸疾病最常見的是胃腸出血,潰瘍又是上消化道出血的最常見原因〔1〕。近年來質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展使用,一定程度上提高了上消化道潰瘍出血的診治效果,但仍有難點尚待解決〔2〕。在心血管疾病如急性心肌梗死(AMI)發(fā)生后,機體的應(yīng)激反應(yīng)及抗血小板聚集等藥物的應(yīng)用是導(dǎo)致心肌梗死后消化道出血的主要原因〔3〕。而非甾體抗炎藥是消化性潰瘍的發(fā)病的獨立影響因素之一,阿司匹林對胃黏膜的損傷成為其臨床應(yīng)用受限的主要原因。中藥赤石脂的主要成分是含水硅酸鋁,具有止血生肌、斂瘡澀腸的功效。實驗研究及臨床觀察顯示赤石脂對應(yīng)激性潰瘍出血及胃腸出血有止血作用,能夠吸附消化道有毒物質(zhì),增強胃黏膜屏障功能〔4〕。本研究以線栓法復(fù)制AMI,并給予阿司匹林制備應(yīng)激后胃黏膜損傷病理模型,觀察赤石脂對胃黏膜形態(tài)學(xué)、血清前列腺素(PG)E2和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、凝血功能及胃組織細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3、自噬效應(yīng)蛋白(Beclin)-1蛋白表達的影響,探討赤石脂對大鼠AMI后應(yīng)用阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜損傷的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠32只,體質(zhì)量為200～220 g,許可證號為SCXK(京)2019-0010,購于(北京)斯貝福生物有限公司。該實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2藥品及制備 水合氯醛(福晨化學(xué)試劑有限公司);阿司匹林(北京索來寶有限公司);奧美拉唑腸溶片(阿司利康制藥有限公司);中藥飲片赤石脂購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。阿司匹林和奧美拉唑分別溶在1%羧甲基纖維素鈉溶液中;赤石脂藥液：根據(jù)人與大鼠的體表面積換算比例得出大鼠每日藥物濃度為4.2 g/kg。

1.3試劑與儀器 PGE2、VEGF試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所);凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時間(TT)試劑盒(希森美康醫(yī)用電子公司);蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑盒(北京索來寶有限公司);β-actin、Beclin1、LC3抗體和二抗辣根過氧化物酶(HRP,Proteintech公司);ERK、P-ERK抗體(美國CST公司)。全自動凝血液分析儀(希森美康醫(yī)用電子有限公司);DR-200BS型酶標儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司);智能熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(廣州光儀生物科技有限公司)。

1.4模型制備與給藥 32只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥對照組和赤石脂組。將模型組、西藥對照組和赤石脂組結(jié)扎左冠狀動脈前降支復(fù)制AMI模型〔5～8〕,以ST段出現(xiàn)弓背向上抬高為造模成功;3 d后灌胃0.2 g/(kg·d)阿司匹林溶液4 d復(fù)制胃損傷出血模型。西藥對照組灌胃給予4 mg/(kg·d)奧美拉唑溶液,赤石脂丸組給予4.2 g/(kg·d)赤石脂湯液,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)7 d。

1.5胃組織的大體變化及潰瘍指數(shù) 沿胃大彎將胃剪開后用水沖洗胃內(nèi)容物,并吸干水分后觀察黏膜的變化,并按Guth標準對胃黏膜出血病灶進行評分：長度<1 mm為1分,1～2 mm為2分,以此類推,損傷寬度>2 mm時,分數(shù)×2,全胃病灶分數(shù)總和為損傷指數(shù)〔9〕。

1.6HE染色法觀察胃組織 多聚甲醛溶液浸泡胃組織24 h,固定、脫水、石蠟包埋、切片后,按照試劑盒進行染色,封片后在顯微鏡下進行觀察。

1.7測定血清PGE2、VEGF含量及血漿PT、TT和FIB含量 腹主動脈取血靜置30 min,離心提取上清液,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測PGE2、VEGF含量。用抗凝管取血靜置后離心提取上層血漿,用凝固法測PT、TT和FIB含量。

1.8Western印跡檢測胃組織中P-ERK1/2、LC3和Beclin-1蛋白表達 取50 mg 胃組織置于液氮速凍后,加入RIPA裂解液進行研磨,冰浴30 min,離心提取上清液,二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育過夜,次日加入二抗孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影,并分析結(jié)果。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0和GraphPad-Prism8.01軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1AMI模型制備成功心電圖 正常組心電圖節(jié)律規(guī)整,各節(jié)段時限正常,各波群振幅、形態(tài)正常;模型組建模后1～5 min會出現(xiàn)心律失常直至出現(xiàn)典型的ST段弓背向上抬高,為AMI模型制備成功心電圖。見圖1。

圖1 正常組與模型組心電圖

2.2赤石脂對胃組織的大體形態(tài)及潰瘍指數(shù)的影響 正常組胃組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,胃黏膜表面光滑,紅潤有光澤,無充血、糜爛及脫落現(xiàn)象,皺襞走形規(guī)整。模型組胃體積增大,胃壁變薄,胃腔可見大量腐臭胃黃褐色血食物混合殘留,胃組織上可見潰瘍出血點,黏膜色澤蒼白,有部分脫落現(xiàn)象,皺襞萎縮變淺,走向紊亂。西藥對照組與赤石脂丸組肉眼觀變化相似,胃組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,胃腔內(nèi)偶見少許食物殘留,胃組織上可見潰瘍出血點較模型組明顯減少,胃黏膜表面較光滑,色紅潤略有充血,尚有光澤,皺襞走形較規(guī)整。見圖2。與正常組(0.00±0.00)比較,模型組胃黏膜損傷指數(shù)明顯升高(12.40±3.65,P<0.01);與模型組比較,赤石脂組、西藥對照組損傷指數(shù)明顯降低(2.40±1.14、3.20±1.30,P<0.01)。

圖2 各組胃大體

2.3赤石脂對胃組織鏡下形態(tài)學(xué)的影響 正常組胃組織黏膜完整,結(jié)構(gòu)排列齊整,未見黏膜充血及糜爛;模型組黏膜上皮缺失、片狀脫落,黏膜下層血管擴張、炎細胞浸潤;赤石脂組和西藥對照組胃黏膜結(jié)構(gòu)相對較完整,腺體排列整齊,未見黏膜脫落等病理變化,炎細胞浸潤少見。見圖3。

圖3 各組胃組織病理形態(tài)學(xué)(HE染色,×400)

2.4赤石脂對胃損傷模型大鼠血清PGE2、VEGF含量的影響 與正常組比較,模型組血清PGE2、VEGF顯著降低(P<0.01);與模型組比較,赤石脂組與西藥對照組血清PGE2、VEGF含量均顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組PGE2、VEGF水平、PT、TT和FIB含量、P-ERK、LC3和Beclin-1蛋白表達

2.5赤石脂對胃損傷模型大鼠血漿中PT、TT和FIB的影響 與正常組比較,模型組凝血系統(tǒng)指標PT、TT明顯延長,FIB含量顯著增高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,赤石脂組和西藥對照組PT、TT均顯著縮短,FIB含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.6赤石脂對胃損傷模型大鼠胃組織P-ERK、LC3和Beclin-1蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組P-ERK/ERK、Beclin-1、LC3表達顯著升高(P<0.01);與模型組比較,赤石脂組和西藥對照組P-ERK/ERK、Beclin 1、LC3表達顯著降低(P<0.01)。見表1、圖4。

圖4 各組P-ERK、LC3Ⅰ、Ⅱ和Beclin-1蛋白表達

3 討 論

赤石脂首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,色赤,甘溫偏補,酸澀能收,治療“黃疸、泄利、腸澼膿血、癰疽瘡瘍”等疾病。《名醫(yī)別錄》中記載“養(yǎng)心氣、治腹痛泄?jié)荨b疽瘡痔、崩漏下、胞衣不出”〔10〕。在《金匱要略》中張仲景應(yīng)用赤石脂,增強溫澀收斂、固腸止血之力多配合溫熱藥,增補養(yǎng)溫暖下焦多配合補益藥〔11〕?？偠灾?赤石脂具有止血生肌,斂瘡澀腸止瀉等作用?，F(xiàn)代研究表明,赤石脂具有既止血、又抗血栓形成,縮短出血時間和凝血時間及抗?jié)冃纬傻淖饔?赤石脂還具有抗炎止瀉、吸附炎性滲出物,保護胃黏膜等作用。本課題組前期研究證實,烏頭赤石脂丸方能夠治療AMI、心肌梗死后心力衰竭及心律失常等疾病〔12～14〕。

胃黏膜損傷是防御與損傷因素失衡而致。PGE2能夠抑制胃酸分泌,增加胃黏液的分泌及胃黏膜血流量,繼而增強胃黏膜抗損傷能力〔15〕。VEGF具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖的作用,有利于潰瘍愈合和黏膜修復(fù)〔16〕。阿司匹林通過抑制環(huán)氧化酶的活性,從而減少PGE2的合成,導(dǎo)致胃黏膜損傷。本研究顯示,赤石脂能夠增加PGE2和VEGF的含量而增強胃黏膜防御保護功能和損傷修復(fù)能力。PT能夠反映外源性的凝血系統(tǒng)功能,而TT能夠反映出內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)功能。FIB為纖維蛋白原,與纖溶系統(tǒng)的聯(lián)系較為密切〔17〕。本研究結(jié)果表明,赤石脂通過激活內(nèi)、外源性凝血途徑及纖溶系統(tǒng)而防治心肌梗死和血栓形成。

自噬是細胞降解蛋白質(zhì)或細胞器以滿足細胞代謝和細胞器更新需要的一種方式。LC3和Beclin是調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白,常作為自噬的標志物〔18,19〕。當自噬發(fā)生時,LC3Ⅰ會經(jīng)泛素化修飾后與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ,因此LC3Ⅰ向Ⅱ轉(zhuǎn)化的程度即機體的自噬程度〔20〕。Beclin1 能夠促進 LC3Ⅰ向Ⅱ轉(zhuǎn)化,并加速自噬體與溶酶體融合而促進自噬〔21〕。當LC3Ⅱ 表達水平上升激活自噬,使線粒體被自噬溶酶體吞噬,影響胃腸活動能量供給,誘導(dǎo)胃腸功能紊亂,從而引發(fā)胃動力障礙〔22〕。本研究表明,赤石脂能夠抑制細胞過度自噬,改善胃腸功能和動力障礙,從而改善胃損傷。