冷琳 劉文佳 吳蔚樺 丁文飛 王玉潔 曹靈

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科 四川省腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,四川 瀘州 646000)

膜性腎病(MN)是全世界成人特發(fā)性腎病綜合征的最常見(jiàn)原因。在中國(guó)過(guò)去的十年間,MN的發(fā)病率每年增加13%,已經(jīng)超過(guò)了免疫球蛋白(Ig)A腎病的趨勢(shì)〔1〕。陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)誘導(dǎo)的MN模型已在多種動(dòng)物身上得到了驗(yàn)證〔2～4〕,其和人類MN在免疫機(jī)制上有共通之處〔3,5,6〕,但在其他機(jī)制方面還需要更多的證據(jù)。貝那普利是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物,是全球改善腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)發(fā)布的臨床實(shí)踐指南中治療特發(fā)性MN藥物之一〔7,8〕。ACEI可降低血壓和蛋白尿,預(yù)防腎臟纖維化,減緩腎病患者腎功能下降,但其腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未被完全闡明。足細(xì)胞凋亡是MN的重要發(fā)病機(jī)制之一。足細(xì)胞病變中機(jī)械壓力或生物力學(xué)應(yīng)變可導(dǎo)致血管緊張素(Ang)Ⅱ過(guò)表達(dá),增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的表達(dá)及活性〔9〕,通過(guò)TGF-β1-P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、TGF-β1-Smads等多種信號(hào)通路,使足細(xì)胞凋亡、脫落、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等,啟動(dòng)腎小球硬化的發(fā)展〔10〕。本研究探討貝那普利對(duì)C-BSA誘導(dǎo)MN大鼠足細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)、體質(zhì)量(140±20)g的雄性SD大鼠24只,由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030〕提供,西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(動(dòng)物倫理編號(hào)20190100006)。

1.2試劑與儀器 貝那普利購(gòu)自北京諾華制藥;AngⅡ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海橋社;免疫組化檢測(cè)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、TGF-β1多克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋,p38MAPK多克隆抗體、腎母細(xì)胞瘤悼蛋白(WT)1多克隆抗體購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司,兔抗鼠IgG抗體購(gòu)自北京Bioss公司;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物。光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡為日本Olympus;圖像分析軟件來(lái)自美國(guó)伯樂(lè)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 將24只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、貝那普利干預(yù)組、貝那普利對(duì)照組,每組6只。正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組不預(yù)免疫、不造模,模型組、貝那普利干預(yù)組參照改良Border方法制作大鼠MN模型〔4〕,預(yù)免疫1 w后開始正式免疫,每只大鼠隔日尾靜脈注射C-BSA(20 mg/kg),連續(xù)4 w,檢測(cè)動(dòng)物尿蛋白均>40 mg/24 h,初步判定造模成功。自正式免疫起,模型組、貝那普利干預(yù)組每日予以貝那普利(10 mg/kg)灌胃,而正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組每日予以1 ml生理鹽水代替,連續(xù)6 w。正式免疫后第5周末收集24 h尿液。各組大鼠于正式免疫后第6周末殺檢,收集腎臟和血清。

1.4血清指標(biāo)檢測(cè) 尿標(biāo)本和血標(biāo)本于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,用全自動(dòng)生化儀行血清白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)檢測(cè),免疫散射速率比濁法測(cè)定24 h尿蛋白濃度(24 h UTP)。

1.5觀察腎臟病理改變 用4%多聚甲醛固定腎組織,脫水、透明并浸蠟,制成2 μm厚的石蠟切片。常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色、過(guò)碘酸六胺銀(PASM)染色和Masson染色觀察腎臟病理改變。

1.6TUNEL法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡 常規(guī)對(duì)5 μm石蠟切片進(jìn)行脫蠟和胃蛋白酶消化。在清潔和干燥切片后,將TUNEL檢測(cè)液滴添加到切片中,并將切片在37 ℃下無(wú)光培養(yǎng)60 min。然后將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體滴在切片上反應(yīng)30 min。DAB顯色、HE染色后,立即用蒸餾水沖洗,脫水,透明中性膠封。結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。如果細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色,則為陽(yáng)性結(jié)果。在高倍(×400)視野下,在每個(gè)切片中隨機(jī)觀察到10個(gè)非重復(fù)和非硬化的腎小球。計(jì)算單個(gè)腎小球中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/有核細(xì)胞總數(shù))作為腎小球凋亡指數(shù)(AI)。

1.7ELISA測(cè)定腎組織勻漿AngⅡ含量 取-80 ℃保存的腎組織4 ℃解凍后切塊。勻漿后加入1.0 ml磷酸鹽緩沖液(PBS),15 000 r/min離心20 min,取上清,按試劑盒說(shuō)明書操作。在酶標(biāo)儀上讀取每孔450 nm波長(zhǎng)下的OD值,根據(jù)樣品的OD值計(jì)算樣品的濃度。

1.8免疫組化法檢測(cè)腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT1蛋白表達(dá) 大鼠腎組織經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋后,5 μm連續(xù)切片,60 ℃烤片,經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后滴加一抗,4 ℃孵育過(guò)夜后加入二抗孵育,DAB室溫顯色。流水沖洗后蘇木素復(fù)染,1%稀鹽酸分化,飽和碳酸鋰返藍(lán)。上述切片用脫水、透明和中性膠密封,并在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍攝結(jié)果。采用Image-pro plus6.0病理彩色圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果行半定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組24 h UTP及血清指標(biāo)比較 正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組24 h UTP無(wú)明顯差別(P>0.05);與正常對(duì)照組相比,模型組、貝非普利干預(yù)組24 h UTP、BUN、Scr水平明顯增加、Alb水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預(yù)組Alb、Scr水平明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組24 h UTP、Alb、Scr、BUN水平及AI比較

2.2腎形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組腎組織無(wú)病理形態(tài)學(xué)改變。模型組、貝那普利干預(yù)組HE染色可見(jiàn)腎小球明顯腫大,腎小球基底膜(GBM)彌漫增厚,毛細(xì)血管袢受壓,管腔狹窄甚至閉塞,球囊腔狹窄甚至粘連,系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生,部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹,腎間質(zhì)膠原纖維明顯沉積,嚴(yán)重纖維化;Masson染色顯示,系膜區(qū)和腎間質(zhì)藍(lán)色陽(yáng)性物質(zhì)增多,系膜區(qū)和腎間質(zhì)增寬;PASM染色顯示腎小球基底膜彌漫性增厚,部分腎小球出現(xiàn)典型的“釘突”形成和“假雙軌”征。貝那普利干預(yù)組病理?yè)p害程度較模型組有所減輕,見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎組織病理形態(tài)(×400)

2.3腎組織中TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1的表達(dá)情況 第6周末正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組在腎小球臟層分布區(qū)域可見(jiàn)TGF-β1、P38MAPK、Bax少量表達(dá),Bcl-2、WT-1有較多表達(dá)。正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比,模型組和貝那普利干預(yù)組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表達(dá)明顯增加,Bcl-2、WT-1表達(dá)明顯減少(均P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預(yù)組腎小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表達(dá)明顯減少,Bcl-2、WT-1表達(dá)明顯增加(均P<0.05),見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達(dá)(免疫組化染色,×400)

表2 各組腎組織勻漿AngⅡ含量、腎組織TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表達(dá)

2.4各組腎組織勻漿中AngⅡ含量的變化 正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組腎組織勻漿中有AngⅡ表達(dá),表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。模型組、貝那普利干預(yù)組腎組織勻漿中AngⅡ含量上升。與正常對(duì)照組相比,模型組、貝那普利干預(yù)組AngⅡ含量均明顯增加(P<0.05);與模型組相比,貝那普利干預(yù)組AngⅡ含量明顯減少(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.5腎組織中細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化 TUNEL染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組、貝那普利對(duì)照組腎小球未見(jiàn)細(xì)胞凋亡,腎小球AI無(wú)明顯差異(P>0.05);模型組、貝那普利干預(yù)組腎小球臟層區(qū)域可見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多,見(jiàn)圖3。與正常對(duì)照組相比,模型組、貝那普利干預(yù)組腎小球AI均明顯增加(P<0.01);與模型組相比,貝那普利干預(yù)組各腎小球AI明顯減少(P<0.05),見(jiàn)表1。

圖3 各組腎小球細(xì)胞(TUNEL染色,×400)

3 討 論

MN是成人腎病綜合征的常見(jiàn)病因〔11〕,常常表現(xiàn)為大量蛋白尿,臨床可以體現(xiàn)為腎病綜合征。一個(gè)理想的模型將有助于了解MN的發(fā)病機(jī)制,從而提高診斷和治療。早在20世紀(jì)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)C-BSA免疫的兔產(chǎn)生了IgG和C3的上皮下沉積,提出了抗原電荷可能是上皮下沉積形成的關(guān)鍵因素〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn),在雙轉(zhuǎn)基因的C-BSA誘發(fā)腎病的小鼠中,Th2 細(xì)胞與高膽固醇血癥和蛋白尿顯著相關(guān)〔3〕。同時(shí)在MN 患者中,Th17細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的炎癥與MN患者血栓形成與復(fù)發(fā)密切相關(guān)〔6〕。Debiec等〔5〕在MN患者上皮下免疫沉積物中發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白,表明C-BSA與帶負(fù)電荷的腎小球毛細(xì)血管壁結(jié)合,隨后形成原位免疫復(fù)合物,C-BSA可能是兒童MN的主要致病靶點(diǎn)之一。因此,C-BSA 誘導(dǎo)的MN 模型可以較好地模擬人類MN 的發(fā)病機(jī)制,而不同的C-BSA劑量在其中至關(guān)重要。根據(jù)本課題組前期研究中采用改良Border方法,使用低中高不同劑量C-BSA,發(fā)現(xiàn)高劑量組能更好地表現(xiàn)MN病理特點(diǎn)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)參照改良Border方法用大劑量C-BSA成功構(gòu)建MN模型,與前期研究相一致。

AngⅡ具有促血管收縮、腎小管水鈉重吸收及細(xì)胞增殖等重要生理功能,是腎素-Ang系統(tǒng)的重要組成成分。早期即有報(bào)道指出,在MN病人腎臟組織中發(fā)現(xiàn)AngⅡ過(guò)表達(dá),且可能參與TGF-β的上調(diào)〔12〕。亦有報(bào)道指出,在5/6腎切除術(shù)大鼠模型中,隨著腎組織中AngⅡ生成的減少,TGF-β1 mRNA表達(dá)量也隨之減少〔13〕。目前較多研究表明,TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)是各種足細(xì)胞損傷的關(guān)鍵介體,而P38MAPK是其信號(hào)通路的樞紐,TGF-β1可調(diào)控P38MAPK導(dǎo)致腎臟的病理?yè)p傷。已有研究證實(shí),TGF-β1可能是糖尿病腎病進(jìn)展的關(guān)鍵因素,在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,咪唑聚酰胺類化合物(PI)靶向TGF-β1治療可促進(jìn)系膜細(xì)胞生長(zhǎng),改善足細(xì)胞損傷,改善腎小球和間質(zhì)變性〔14〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,C-BSA誘導(dǎo)MN模型與人類MN在除了免疫方面以外的其他機(jī)制上也有一定的相似之處,為其模擬人MN可靠性提供了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

貝那普利是臨床常用的ACEI類降血壓藥物。大量研究顯示〔15～17〕,除通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)發(fā)揮作用外,ACEI還可通過(guò)抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗纖維化等機(jī)制發(fā)揮作用,但ACEI類藥物在MN中具體的作用靶點(diǎn)尚不完全清楚,因此確定ACEI發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制對(duì)于深入了解MN的治療是十分必要的。貝那普利可降低DN大鼠及高糖誘導(dǎo)的RMCs中NF-κB、TGF-β、TRPC6水平,抑制高糖誘導(dǎo)的RMCs凋亡,改善DN大鼠腎功能,減輕腎臟損傷〔18〕。ACEI抑制AngⅡ的產(chǎn)生,降低TGF-β的表達(dá)和明顯炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而抑制IL-33/sST2減少風(fēng)濕性心臟病纖維化的進(jìn)展〔19〕,也可能通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)的表達(dá)或抑制活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)NOX4的反應(yīng)發(fā)揮抗肝纖維化作用〔20〕。在狼瘡小鼠模型中,卡托普利可降低腦、脾和腎Ⅰ型干擾素應(yīng)答基因的表達(dá),降低循環(huán)和組織干擾素-α水平,降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化和減少抑郁樣行為,還能降低血漿中的自身抗體水平及腎和腦中的免疫復(fù)合物沉積發(fā)揮治療作用〔21〕。本研究結(jié)果表明,貝那普利很可能通過(guò)抗足細(xì)胞凋亡對(duì)MN大鼠腎臟發(fā)揮保護(hù)作用,再次證明了貝那普利預(yù)防或治療MN的潛力。

貝那普利可抑制AngⅡ的經(jīng)典生成途徑,推測(cè)貝那普利可能通過(guò)減少AngⅡ生成來(lái)抑制TGF-β1相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用。在糖尿病大鼠模型中證實(shí)使用AT1R拮抗劑能有效地降低腎小球TGF-β1的生成量〔22〕。本研究結(jié)果表明,貝那普利很可能通過(guò)減少AngⅡ,進(jìn)而抑制TGF-β1/P38MAPK信號(hào)通路對(duì)MN腎臟發(fā)揮保護(hù)作用。但有研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病腎病小鼠中,缺乏Ca2+結(jié)合蛋白Swiprosin-1可激活TGF-β1/P38MAPK信號(hào)通路,從而降低線粒體依賴途徑導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡,同時(shí)在體外高糖誘導(dǎo)的MPC-5足細(xì)胞中P38MAPK靶向敲低后,細(xì)胞凋亡增加〔23〕。因此,TGF-β1/P38MAPK信號(hào)通路在不同條件影響下與足細(xì)胞凋亡的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

綜上,C-BSA誘導(dǎo)的MN大鼠與人MN在免疫方面以外的其他發(fā)病機(jī)制上具有一定的相似之處,為構(gòu)建和完善理想的MN實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮黾恿烁嗟膶?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。貝那普利可以減輕C-BSA誘導(dǎo)的MN大鼠足細(xì)胞損傷,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,其機(jī)制與抑制TGF-β1/P38MAPK信號(hào)通路活性有關(guān),這為研究ACEI類藥物對(duì)MN治療機(jī)制提供了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。ACEI類藥物在臨床應(yīng)用于許多疾病的治療,但其作用機(jī)制有待深入研究。