姚玉喬 徐龍劍 楊俊 胡明德 楊沛月 許淑珍

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院肛腸科,江西 南昌 330006;2研究學(xué)院)

功能性便秘是胃腸道功能障礙性疾病的常見疾病,腸道菌群失衡是功能性便秘發(fā)生的重要病因〔1,2〕。目前功能性便秘治療手段以糾正菌群紊亂為主,調(diào)整腸道內(nèi)各種菌屬平衡狀態(tài)對防治功能性便秘具有關(guān)鍵意義。雖然糞便移植、益生菌等治療功能性便秘,取得了一定療效〔3～5〕,但是上述治療手段均存在理論風(fēng)險(xiǎn),如益生菌過度使用引起的全身性感染〔6〕、易感個(gè)體的過度免疫刺激〔7〕等副作用。中醫(yī)藥治療便秘,具有副作用小、療效可觀、患者依從性強(qiáng)等優(yōu)勢,可以作為未來研究和治療功能性便秘的重要方向。本研究通過觀察枳術(shù)湯對功能性便秘大鼠療效,初步探討腸道菌群及5-羥色胺(HT)對腸道傳輸功能的影響作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠16只,雌雄各半,平均體質(zhì)量(165±15)g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號SCXK(湘)2019-0004,本研究通過了動物倫理委員會批準(zhǔn),符合人類的道德倫理標(biāo)準(zhǔn)和國際慣例符合倫理要求。

1.2藥物、試劑與儀器 主要藥物：復(fù)方地芬諾酯片(批號：2104018,廠家：常州康普藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32022716)。莫沙比利片(批號：26210312,廠家：魯南貝特制藥有限公司,批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19990317)。枳術(shù)湯：3.03 g/10 g白術(shù)顆粒劑、1.16 g/10 g炒枳實(shí)顆粒劑以150 ml沸水沖泡。復(fù)方地芬諾酯混懸液：取復(fù)方地芬諾酯片250 mg打磨成細(xì)粉,加入165 ml純水配制成濃度為1.5 mg/ml的復(fù)方地芬諾酯混懸液。莫沙比利劑：取1片莫沙比利片5 mg,打磨成細(xì)粉,再加入20 ml純水配制成濃度為0.25 mg/ml的莫沙比利劑。主要試劑：DNA提取試劑盒(廠家：Promega公司,批號：LS5247)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(廠家：Promega公司,批號：B202138)。5-HT試劑盒(廠家：上海西唐生物技術(shù)有限公司,批號：12207331。主要儀器：高速離心機(jī)屬德國Eppendorf公司產(chǎn)品,電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)屬美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3功能性便秘模型建立 取12只大鼠分為對照組、模型組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組,每組4只,雌雄各半,參照文獻(xiàn)動方法〔8〕,通過灌胃15 mg/ml復(fù)方地芬諾酯混懸液(10 ml/kg)建立功能性便秘模型。另取4只大鼠為對照組,雌雄各半,灌胃同等體積純水。7 d為1個(gè)療程,每個(gè)療程間暫停1 d?？偣补辔?6次,即8個(gè)療程。飼養(yǎng)條件：濕度40%～70%,溫度25 ℃。

1.4實(shí)驗(yàn)給藥 建立模型成功后,枳術(shù)湯組灌服枳術(shù)湯(10 ml/kg),莫沙比利組灌服莫沙比利劑(2.5 mg/kg),模型組和對照組灌胃等體積生理鹽水,2次/d,連續(xù)7 d。

1.5大鼠胃腸排空時(shí)間及糞便含水率檢測 末次給藥后,禁食不禁水12 h,經(jīng)口灌服3 ml活性炭混懸液,記錄灌服活性炭混懸液結(jié)束時(shí)間和第1粒黑便排除時(shí)間,計(jì)算各組胃腸排空時(shí)間(胃腸排空時(shí)間=第1粒黑便排除時(shí)間-灌服活性炭混懸液結(jié)束時(shí)間)。稱取第1粒黑便重量為濕重,置入干燥箱烘干后,再次稱取糞便重量為干重,計(jì)算糞便含水率〔糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%〕。

1.6結(jié)腸肌電的檢測 觀察大鼠排便結(jié)束后,所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(4 ml/kg)進(jìn)行麻醉,固定大鼠四肢,剪除腹部皮毛,暴露皮膚,進(jìn)行消毒后沿腹正中線切開,鈍性分離充分暴露大鼠結(jié)腸段。用一次性采血針頭作套針穿刺腸壁漿肌層,將導(dǎo)線的裸露段銀絲埋藏于肌層里作為其中一根電極。距該電極1 cm處(結(jié)腸段),使用同樣操作方式插入另一根電極,連接兩根電極于Power Lab的生物電記錄儀上,記錄大鼠結(jié)腸肌電振幅和頻率的變化。

1.7大鼠腸道菌群分析 取大鼠大便于實(shí)驗(yàn)管中,加入DNA提取試劑盒來提取DNA。取提取的DNA作為目標(biāo)基因,稀釋后取2.5 ng作為模板,利用帶有Barcode的16 S V4通用引物(515F-806R) 進(jìn)行PCR。計(jì)算腸道菌群的菌門相對分度,分析大鼠腸道菌群結(jié)果特征。

1.8大鼠血清5-HT含量測定 結(jié)腸肌電檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采集腹主靜脈集血液5 ml,離心機(jī)離心后取上層清液,根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書,利用ELISA測定血清5-HT含量。

1.9Western印跡檢測蛋白相對表達(dá)量 處死大鼠后,迅速分離各組大鼠結(jié)腸組織,清洗濾干后加入10%甲醛固定,用放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液裂解組織,10 000 r/min離心10 min,取上清液,提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白純度,吸取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜,將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。加入封閉液,室溫條件下封閉1 h,加入5-HT3R抗體(1∶1 000)、5-HT4R抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶1 000),4 ℃過夜孵育。利用磷酸鹽緩沖液充分洗膜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h。利用凝膠成像儀檢測灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1枳術(shù)湯對大鼠胃腸排空時(shí)間及糞便含水率的影響 與對照組比較,模型組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組胃腸排空時(shí)間明顯延長,糞便含水率明顯降低(均P<0.05);與模型組比較,莫沙必利組和枳術(shù)湯組胃腸排空時(shí)間明顯縮短,糞便含水率明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組胃腸排空時(shí)間、糞便含水率、肌電頻率和振幅、血清5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)比較

2.2枳術(shù)湯對大鼠結(jié)腸肌電的影響 與對照組比較,模型組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組結(jié)腸肌電頻率明顯降低,振幅明顯增高(均P<0.05);與模型組比較,莫沙必利組和枳術(shù)湯組結(jié)腸肌電頻率明顯升高,振幅明顯降低(均P<0.05)。見表1。

2.3枳術(shù)湯對大鼠血清5-HT表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組大鼠血清5-HT含量明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,莫沙必利組和枳術(shù)湯組血清5-HT含量明顯降低(均P<0.05)。見表1。

2.4枳術(shù)湯對大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05);與模型組比較,莫沙必利組和枳術(shù)湯組結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)量明顯升高(均P<0.05)。見表1。

2.5枳術(shù)湯對大鼠腸道菌群門分布的影響 所有樣本菌群由變形菌門、擬桿菌門、螺旋菌門和厚壁菌門、其他菌門構(gòu)成。與模型組比較,對照組、莫沙必利組和枳術(shù)湯組變形菌門相對豐度明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,莫沙必利組和枳術(shù)湯組變形菌門相對豐度明顯降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組腸道菌群菌門相對豐度

3 討 論

枳術(shù)湯是《金匱要略》名方,廣泛用于臨床中,隨著中醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展,針對多種疾病,枳術(shù)湯衍化出多種變方,治療多種疾病具有顯著效果。研究顯示枳術(shù)湯及其變方治療的優(yōu)勢病種為消化系統(tǒng)疾病,包括功能性消化不良〔9〕、功能性便秘〔10〕、腸易激綜合征〔11〕等,通過雙向調(diào)節(jié)作用影響食道、胃、大小腸動力,從而改善消化系統(tǒng)疾病。本研究的枳術(shù)湯由白術(shù)顆粒劑與炒枳實(shí)顆粒劑混合制成,是健脾理氣方中的經(jīng)典藥對,具有消食化積、消痞除滿之功〔12〕。本研究結(jié)果提示,腸道傳輸功能出現(xiàn)異常,建模的大鼠出現(xiàn)功能性便秘。而應(yīng)用枳術(shù)湯治療的功能性便秘大鼠,胃腸排空時(shí)間縮短,糞便濕重增加,表明枳術(shù)湯治療功能性便秘大鼠具有重要療效。王郁金等〔13〕認(rèn)為,結(jié)腸肌電頻率和振幅改變,與結(jié)腸平滑肌收縮相關(guān),亦可作為評估腸道傳輸功能的指標(biāo)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),枳術(shù)湯有利于腸道傳輸。

研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群紊亂是功能性便秘始作俑者,當(dāng)腸道菌群平衡狀態(tài)被打破時(shí),會影響身體的新陳代謝,在病理生理作用下,加劇便秘〔14〕。正常腸道含有多種致病菌和生理性細(xì)菌,在正常生理狀態(tài)下,這些細(xì)菌處于相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài),它們以各種方式參與身體的生理功能,如通過分泌含酶的代謝物補(bǔ)充消化酶,促進(jìn)體內(nèi)物質(zhì)的消化、吸收和代謝,或加速高產(chǎn)內(nèi)膜上皮細(xì)胞的發(fā)育和血管組織的再生,穩(wěn)定人體免疫系統(tǒng),防止病原菌繁殖和分化〔15～17〕。腸道菌群動態(tài)平衡失調(diào),加劇病原菌增殖,大量致病菌的釋放會增加人體腸道內(nèi)的內(nèi)毒素,破壞腸黏膜屏障,導(dǎo)致腸道功能障礙〔18,19〕。5-HT是一種重要的膽堿能遞質(zhì),能改善腸道通透性,增加腸道滲透壓,增加水分分泌,促進(jìn)腸道蠕動,對調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動和胃腸分泌功能起重要作用〔20〕。當(dāng)腸道受到刺激時(shí),腸嗜鉻細(xì)胞會釋放大量5-HT,其與腸道上的5-HT受體結(jié)合,發(fā)揮生理作用〔21〕。5-HT3R、5-HT4R最為5-HT重要結(jié)合受體,對調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動功能具有關(guān)鍵性作用,5-HT3R激活時(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+的濃度,有助于提高胃腸道運(yùn)動能力〔22〕。5-HT4R激活后促進(jìn)平滑肌收縮,亦有助于腸道運(yùn)動。本研究結(jié)果說明,枳術(shù)湯能夠改善功能便秘大鼠腸道菌群失衡。此外,本研究結(jié)果表明,5-HT結(jié)合受體后,結(jié)腸受體表達(dá)減少,側(cè)面證實(shí)5-HT對腸道運(yùn)動作用的影響。