吳勇宏 付聰 劉翰 田立群 段剛峰 卜文玉 柯于鶴

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖北 武漢 430000)

缺血性心臟病(IHD)是全世界范圍內(nèi)致死的主要病因之一,每年造成900萬人死亡,緊急時呈現(xiàn)為急性心肌梗死(AMI)〔1〕。AMI與高發(fā)病率和死亡率有關(guān),可造成不可逆轉(zhuǎn)的心肌損傷,迅速而有效地恢復(fù)缺血心肌的血流灌注對于限制梗死大小和挽救缺血性心肌至關(guān)重要〔2〕。然而,隨著再灌注療法在AMI患者中的廣泛應(yīng)用,缺血引起的心肌損傷明顯減少,但再灌注引起的心肌損傷日益明顯〔3〕。且再灌注可能會加劇致命的組織損傷,這種現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注(I/R)損傷〔2〕。I/R損傷的特點包括微血管灌注缺陷、血小板激活和連續(xù)心肌細胞死亡,其中微血管阻塞,即無復(fù)流現(xiàn)象,決定了梗死區(qū)、心肌功能和術(shù)外死亡率〔3〕。而微血管阻塞引起的微循環(huán)功能障礙是死亡的獨立危險因素,通常出現(xiàn)在心力衰竭等重病的早期階段〔4〕。心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷可能比心肌細胞損傷發(fā)生得更早,嚴重程度要大得多〔3〕。在I/R損傷過程中,心肌微血管的損傷很可能是心肌損傷的起始因素,因此,保護心肌微血管內(nèi)皮細胞(RCMECs)能減輕心肌I/R損傷。在改善缺血心肌方面,中醫(yī)藥治療優(yōu)勢明顯。其中,從蔥科植物細香蔥成熟莖下端蔥白中提取的一類活性成分被發(fā)現(xiàn)可以有效抗氧化損傷、改善缺血心肌〔5,6〕。楊淑華等〔7〕研究結(jié)果也顯示,蔥白提取物(FOB)對I/R損傷具有保護作用。楊劍鋒等〔8〕研究結(jié)果同樣表明,FOB具有改善I/R模型大鼠心功能作用,且其機制與調(diào)節(jié)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路蛋白表達、抗心肌細胞凋亡相關(guān)。本課題探討FOB對RCMECs細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MEK/ERK)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞(RCMECs)購自賽佰康;FOB來源于武漢市第一醫(yī)院;培養(yǎng)基199(M199)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型膠原(Collagenase Ⅱ)、青鏈霉素(雙抗)購自Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、肝素鈉、抗熒光衰減封片劑〔含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)〕、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液購自Solarbio公司;DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-AcLDL)購自thermofisher公司;重組鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)購自PeproTech公司;基質(zhì)膠購自CORNING公司;CCK8溶液購自北京索萊寶科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)定量測定試劑盒購自金克隆公司;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自DOCLAB公司;化學(xué)發(fā)光試劑購自rongbai公司;兔抗大鼠細胞周期素(Cyclin)D2抗體,兔抗多重腫瘤抑制基因(P16)抗體,兔抗MEK抗體,兔抗p-MEK抗體,兔抗ERK抗體,兔抗p-ERK1/2抗體購自Bioswamp公司。

1.2細胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將收集的細胞用完全培養(yǎng)基(M199+20%FBS+1%雙抗+50 μg/ml肝素鈉)重懸,接種至T25瓶后每2 d換液。取正常細胞樣本(12孔板),加入1 ml 4%多聚甲醛室溫固定20 min,棄固定液用1 ml PBS洗2遍,每次3 min,棄PBS,再加入1 ml 15 μg/ml LDL染色液,37 ℃孵育4 h,PBS重復(fù)洗后加入500 μl含DAPI的抗熒光衰減封片劑,室溫孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察拍照鑒定。

1.3FOB對RCMECs毒性作用 用不同濃度的FOB(0、1、10、20、50、100 μg/ml)干預(yù)正常RCMECs細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞。處理細胞24、48和72 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測450 nm處各孔的吸光值。

1.4細胞氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型構(gòu)建及鑒定 將細胞置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細胞貼壁,再于1% O2,5% CO2及95% N2中培養(yǎng)2 h后換正常條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h〔9〕。取出細胞培養(yǎng)板,向每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 處測量各孔的吸光值,檢測OGD模型細胞活力。

1.5CCK8檢測細胞增殖 OGD/R前加入FOB預(yù)孵育1 h(0、1、10、20、50、100 μg/ml),再構(gòu)建OGD/R模型,調(diào)整細胞懸液濃度,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞,培養(yǎng)過夜。根據(jù)不同分組處理細胞24、48和72 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測450 nm處各孔吸光值,選擇FOB最佳作用濃度為50 μg/ml。

1.6細胞分組 將細胞分為對照組、模型組、低、中、高劑量組。對照組細胞不做處理,正常培養(yǎng);模型組構(gòu)建OGD/R模型;低、中、高劑量組分別用12.5、25、50 μg/ml的FOB預(yù)處理1 h再構(gòu)建OGD/R模型。

1.7生化檢測細胞LDH活性 收集細胞,根據(jù)LDH測定試劑盒說明書檢測LDH釋放量。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測細胞中MEK和ERK1/2 mRNA表達水平 收集各組細胞,取1×106個細胞,利用Trizol法提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將制備好的cDNA進行PCR擴增。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,共40個循環(huán)。引物序列MEK正向5′-GACGCAGAAGCAGAAGGTG-3′,反向5′-GTAGAAGCCCACTATGTACGG-3′;ERK1/2正向5′-ATAGGC ATCCGAGACATCC-3′,反向5′-GCTCAGGGTCAGCA ATCC-3′;β-actin正向5′-CGTTGACATCCGTAAA GAC-3′,反向5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。以β-actin為內(nèi)參,2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.9Western印跡檢測細胞中CyclinD2、P16和MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達水平 取1×106個細胞,提取細胞總蛋白質(zhì)后取20 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上封閉4 ℃過夜。根據(jù)說明書稀釋一抗孵育1 h,洗膜后加入按照 1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h,洗膜。加入化學(xué)發(fā)光試劑,與膜充分接觸后,置于全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測,讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1微血管內(nèi)皮細胞鑒定 90%以上的細胞呈因子陽性,并且能夠攝取Dil-Ac-LDL,表明培養(yǎng)的細胞為內(nèi)皮細胞。見圖1。

圖1 RCMECs鑒定(免疫雙標染色,×200)

2.2FOB對正常RCMECs細胞毒性作用比較 FOB對正常RCMECs細胞具有毒性作用,且毒性作用隨著濃度的升高和時間延長逐漸增大。見表1。

表1 各組FOB細胞毒性及增殖能力比較

2.3FOB對各組OGD/R細胞增殖能力的比較 OGD/R細胞增殖能力隨著FOB作用時間的增加而增強,72 h時細胞增殖能力最高;作用72 h時,20、50、100 μg/ml的增殖能力無明顯差異,但48 h時,50 μg/ml時增殖能力最高。見表1。因此,FOB最佳作用時間為48 h,濃度為50 μg/ml。

2.4OGD/R模型的鑒定 OGD/R組細胞活力(0.75±0.02)較對照組(0.94±0.01)顯著降低(t=19.08,P<0.05),表明OGD/R模型構(gòu)建成功。

2.5各組細胞LDH活性比較 模型組細胞LDH活性顯著高于對照組(P<0.05)。低、中、高劑量組細胞LDH活性均顯著低于模型組,且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞LDH活性、CyclinD2、P16蛋白、MEK和ERK1/2 mRNA及磷酸化水平比較

2.6各組細胞CyclinD2和P16蛋白表達水平比較 與對照組比較,模型組細胞CyclinD2蛋白表達水平顯著降低,P16蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,除低劑量組細胞CyclinD2蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05),其他劑量組細胞CyclinD2蛋白表達水平顯著升高且呈上升趨勢,P16蛋白表達水平顯著降低且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

1～5：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖2 FOB對RCMEC細胞CyclinD2、P16蛋白表達及MEK、ERK1/2磷酸化的影響

2.7各組細胞中MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化水平 與對照組比較,模型組細胞MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,各劑量組細胞MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化顯著升高,且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

3 討 論

LDH是一種存在于幾乎所有身體組織的酶,可以標記各種組織損傷〔10〕。組織損傷的病因有AMI、貧血、肺栓塞、肝炎、急性腎衰竭等疾病〔11〕。組織損傷后,細胞在血液中釋放LDH,血清中的LDH升高,肝病、肌肉損傷、心臟病發(fā)作等都可能導(dǎo)致血液中LDH活性升高,在AMI中,LDH-1異構(gòu)體從第2天一直升高到第4天,而治療期間LDH活性降低則表明AMI或肝損傷等疾病對治療的預(yù)后或反應(yīng)良好〔10〕。Wu等〔12〕研究結(jié)果顯示,生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子(GAS)5下調(diào)可減輕離體心肌I/R損傷使其LDH活性降低。本文結(jié)果提示,缺血能引起心肌細胞膜損傷,FOB對心肌I/R損傷有保護作用,且濃度越高損傷越小。

CyclinD2是調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)4活性的輔助因子,CDK4介導(dǎo)細胞周期通過限制點的轉(zhuǎn)運,CyclinD2在成年心肌細胞中的靶向表達誘導(dǎo)內(nèi)源性CDK4的表達,研究表明,CyclinD2轉(zhuǎn)基因小鼠在成年心臟中表現(xiàn)出持續(xù)的心肌細胞更新〔13〕。而P16是衰老的體內(nèi)生物標志物,低水平P16的細胞因衰老而經(jīng)歷細胞周期停滯〔14〕。成人心臟干細胞衰老與生理和病理過程有相應(yīng)的關(guān)聯(lián),包括心肌損傷修復(fù)和器官功能障礙等,而衰老主要通過P16等的激活來執(zhí)行〔14〕。本研究提示,FOB可抑制RCMECs的P16蛋白表達,促進CyclinD2蛋白表達,即延緩心肌細胞衰老,促進其更新。

研究發(fā)現(xiàn),MEK/ERK信號抑制了用奧洛平治療的老鼠心肌I/R損傷〔15〕。蔣智等〔16〕研究結(jié)果也顯示,子宮內(nèi)膜干細胞來源細胞因子“雞尾酒”(EdCC)通過激活MEK1-ERK1/2信號通路減輕心肌I/R損傷。富丹婷等〔17〕研究結(jié)果顯示,纖維肉瘤(Raf)/MEK/ERK通路在心肌肥大中的調(diào)控作用,可能通過激活關(guān)鍵因子c-Raf、MEK1、MEK2、ERK1和ERK2特異性位點的磷酸化實現(xiàn)的。本研究提示,FOB可激活心肌微血管內(nèi)皮細胞MEK/ERK1/2通路,且濃度越高效果越好。

綜上,FOB可以調(diào)控RCMECs的活性,其作用機制可能與激活MEK/ERK通路有關(guān)。