崔光銳 楊維忠 邱堅(jiān) 林文會(huì)

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡科,海南 ?？?570311)

胃癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤,具有較高的致死率,位居所有惡性腫瘤死亡率第二位,嚴(yán)重威脅者患者的生命健康,也給個(gè)人及家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔1〕。研究表明,胃癌的發(fā)生和發(fā)展與異常表達(dá)的胃腸道激素有著密切的關(guān)系,而胃泌素就是一種胃腸道激素〔2〕。胃泌素由胃竇部G細(xì)胞產(chǎn)生的胃腸肽激素,主要作用是促進(jìn)胃酸分泌及保護(hù)胃黏膜,同時(shí)發(fā)現(xiàn)胃泌素在胃癌發(fā)生及發(fā)展的過程中有著重要的作用〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕,胃泌素是一種促生長(zhǎng)因子,胃腸的腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生胃泌素,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化的作用,出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌患者胃泌素的表達(dá)量明顯高于原發(fā)胃癌組織,推測(cè)胃泌素與胃癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wnt/β-catenin通路與多種人類癌癥發(fā)展密切相關(guān),能參與癌細(xì)胞生長(zhǎng)分化、遷移和侵襲等過程影響癌癥進(jìn)展〔5〕。本文探討胃泌素調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞MKN45購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司;人胃泌素、丙谷胺、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)總蛋白檢測(cè)試劑盒、Transwell小室購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;一抗、二抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;c-myc抗體、Wnt3a抗體、β-catenin抗體購(gòu)自北京博奧森公司;電泳儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人胃癌細(xì)胞MKN45放置含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,傳代培養(yǎng)時(shí),加入胰酶消化培養(yǎng),每2 d換1次培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以1×105/孔接種于6孔板中,將細(xì)胞分為對(duì)照組(不進(jìn)行任何藥物處理)、胃泌素組(12.50 mg)、丙谷胺組(16.00 mg/L)及胃泌素聯(lián)合丙谷胺組(12.50 mg/L胃泌素與16.00 mg/L丙谷胺),每組8株人胃癌細(xì)胞MKN45。

1.3檢測(cè)人胃癌細(xì)胞MKN45增殖能力 每組細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi),用不同條件處理24 h后在每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl MTT試劑盒檢測(cè)液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出培養(yǎng)板并震蕩,而后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1.4檢測(cè)人胃癌細(xì)胞MKN45遷移能力 各組MKN45細(xì)胞以胰酶消化,鋪板6孔板,待細(xì)胞貼壁后呈單層匯合時(shí),使用無菌槍頭做劃痕,觀察并記錄劃痕距離,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,再次觀察并記錄劃痕寬度。

1.5檢測(cè)人胃癌細(xì)胞MKN45侵襲能力 各組MKN45細(xì)胞以無血清培養(yǎng)液洗滌并調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml,上室添加100 μl細(xì)胞懸液,下室添加含10%胎牛血清培養(yǎng)液500 μl,培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗小室,拭去上室膜的細(xì)胞,多聚甲醛固,結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)穿膜至小室的細(xì)胞數(shù)。

1.6檢測(cè)人胃癌細(xì)胞MKN45凋亡率 密度為1×106個(gè)/ml細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)48 h后,離心收集細(xì)胞,添加膜聯(lián)蛋白(Annexin)-Ⅴ、碘化丙啶(PI)染液,室溫下避光孵育15 min。通過30 μm篩網(wǎng)過濾單個(gè)細(xì)胞,Annexin-Ⅴ和PI雙重染色壞死細(xì)胞,Annexin-Ⅴ染色凋亡細(xì)胞,置于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7Western印跡法檢測(cè)相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 培養(yǎng)24 h后細(xì)胞進(jìn)行裂解并制備成電泳上樣液,BCA法檢測(cè)上樣液濃度后計(jì)算具體上樣量,電泳后轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉、洗膜后,孵育c-myc、Wnt3a、β-catenin一抗(均1∶1 000稀釋)過夜,次日經(jīng)洗膜后常溫下孵育二抗,時(shí)間為90 min,洗膜3次后用吸水紙吸干膜上多余液體,放入暗室內(nèi)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖能力比較 與對(duì)照組相比,胃泌素組細(xì)胞增殖能力明顯升高,丙谷胺組細(xì)胞的增殖能力明顯降低,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖、遷移、侵襲、凋亡能力及相關(guān)通路蛋白表達(dá)比較

圖1 各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖能力(MTT,×200)

2.2各組人胃癌細(xì)胞MKN45遷移能力比較 與對(duì)照組相比,胃泌素組人胃癌細(xì)胞MKN45遷移能力明顯升高,丙谷胺組MKN45遷移能力明顯降低,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯升高(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組人胃癌細(xì)胞MKN45遷移能力(×200)

2.3各組人胃癌細(xì)胞MKN45侵襲能力比較 與對(duì)照組相比,胃泌素組人胃癌細(xì)胞MKN45侵襲能力明顯升高,丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯降低,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯升高(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組人胃癌細(xì)胞MKN45侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4各組人胃癌細(xì)胞MKN45凋亡能力比較 與對(duì)照組相比,胃泌素組人胃癌細(xì)胞MKN45凋亡能力明顯降低,丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯升高,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯降低(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯升高(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯降低(P<0.05),見表1、圖4。

圖4 各組人胃癌細(xì)胞MKN45凋亡

2.5各組相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,胃泌素組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高,丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯(lián)合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),見表1、圖5。

3 討 論

隨著人們不良的作息和飲食習(xí)慣,目前胃癌的發(fā)生率都在逐年升高,同時(shí)死亡率也在逐年升高〔6〕。在中國(guó)胃癌屬于高發(fā)國(guó)家,每年患有胃癌的人數(shù)占全球的40%左右〔7〕。通常發(fā)生胃癌原發(fā)腫瘤的死亡人數(shù)比較小,僅占10%,大多數(shù)患者主要死于胃癌的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,尤其是肝轉(zhuǎn)移〔8〕。而胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移是胃癌主要的病理學(xué)特征,由于這個(gè)病理學(xué)特征,使得胃癌在醫(yī)學(xué)上的治療比較困難,同時(shí)也會(huì)使患者的預(yù)后不佳〔9〕。

研究發(fā)現(xiàn),胃癌的發(fā)生及發(fā)展與胃泌素有著密切的關(guān)系,同時(shí)已有研究證實(shí),胃泌素可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,可以將胃泌素作為臨床診斷早期胃癌的標(biāo)志〔10,11〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中胃泌素的表達(dá)含量明顯高于其鄰近正常組織,胃泌素的上調(diào)與胃癌的發(fā)生機(jī)制有著密切的關(guān)系〔12〕。胃泌素的主要作用機(jī)制促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,并抑制胃癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)刺激胃癌細(xì)胞,導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤血管等〔13〕。本研究結(jié)果表明,胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,丙谷胺阻滯胃泌素對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖作用,這與劉駿〔14〕等研究結(jié)果相符合。本研究結(jié)果表明,胃泌素可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,降低其凋亡能力,丙谷胺可以降低胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,增強(qiáng)其凋亡能力。此外,說明丙谷胺可拮抗胃泌素促進(jìn)的胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力,這與王斌峰等〔15〕研究結(jié)果相符合。

Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一類傳導(dǎo)生長(zhǎng)刺激信號(hào)的通路,由細(xì)胞外的Wnt3a蛋白及胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin及下游的轉(zhuǎn)錄因子組成〔16〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白,c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)〔17〕。wnt/p-catenin也被稱為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,該通路主要通過β-catenin的核易位,激活下游IE基因的轉(zhuǎn)錄〔18〕。一些激素或因子激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,導(dǎo)致某些復(fù)合物對(duì)β-catenin磷酸化產(chǎn)生抑制作用,β-catenin降解被減少,使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚積并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移〔19〕。胃泌素通過某些上調(diào)基因表促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的能力,抑制其凋亡能力,表明Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路〔20〕。本研究結(jié)果表明,胃泌素上調(diào)Wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-myc的表達(dá),因此胃泌素對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有一定的活化作用,而丙谷胺可以抑制胃泌素這一作用。

綜上,胃泌素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平,并促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力,抑制其凋亡能力。