劉順利 粱萌萌 劉大英 劉夏輝 何偉

(1河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河北 滄州 061000;2滄州師范學(xué)院生命科學(xué)系)

過敏性鼻炎(AR)作為醫(yī)院耳鼻喉科較常見病癥之一,由于環(huán)境影響發(fā)病率呈逐年上升趨勢〔1〕。AR的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣且關(guān)聯(lián)因素較多,與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),若不及時進(jìn)行有效的診療,可對鼻黏膜組織造成一定的影響,并可能演變?yōu)橹夤芟?、鼻息肉及鼻竇炎等多種疾病〔2〕。AR的產(chǎn)生還往往伴有明顯的白三烯水平異常、氣道收縮及黏液分泌失衡等。半胱氨酰白三烯(CysLTs)作為一種具有關(guān)鍵性的炎癥介質(zhì),可經(jīng)CysLT1、CysLT2等受體亞型而發(fā)揮作用,可參與支氣管哮喘、AR等多種炎癥疾病發(fā)生發(fā)展〔3〕。Toll樣受體(TLRs)家族在機(jī)體免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵性作用,在與相對應(yīng)的配體聯(lián)合后通過集合通路干預(yù)人體中相關(guān)免疫炎性反應(yīng)。激活蛋白(AP)-1是由原癌基因蛋白(C-Jun)及細(xì)胞癌基因fox蛋白(C-Fos)核蛋白基因相互構(gòu)成,存在于TLR9信號通路的下游部分,在參與AR相關(guān)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)炎癥發(fā)生等方面具有重要作用〔4〕。近年來,對于中醫(yī)藥在臨床疾治療中的應(yīng)用越來越廣泛,而中藥方劑玉屏風(fēng)顆粒是從元朱丹溪的《丹溪心法》之中而來,由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)等多種中藥材組成,具有增強免疫、抑汗抗菌、補氣中位、預(yù)防過敏等多中藥理學(xué)功效,且在臨床中也多有應(yīng)用〔5〕。本研究探討玉屏風(fēng)顆粒通過調(diào)控TLR9/AP-1信號通路對AR大鼠鼻黏膜重塑、白三烯水平及免疫調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取健康大鼠60只,體質(zhì)量120～230 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2020-0035,飼養(yǎng)室溫環(huán)境15～22 ℃,每日光照12 h,濕度35%～60%,喂養(yǎng)條件以自來水及標(biāo)準(zhǔn)飼料自由攝取在動物實驗室常規(guī)飼養(yǎng),大鼠實驗中的所有操作步驟嚴(yán)格依據(jù)實驗動物倫理委員會與使用指南嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2藥物、試劑與儀器 玉屏風(fēng)顆粒(廣東環(huán)球制藥有限公司,批號161315),氯雷他定(上海拜耳醫(yī)藥有限公司,批號SH00426),白細(xì)胞介素(IL)-4、組胺(HIS)、免疫球蛋白(Ig)E、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒 (天津安諾康生物技術(shù)有限公司,批號384170692、337170718、348170718、366170714),戊巴比妥鈉(成都市科龍化工試劑廠,批號2016083062),C-Fos、C-Jun抗體(美國Santa Cruz公司),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(上海滬峰化工有限公司),卵清蛋白(美國Sigma-Aldrich公司),氫氧化鋁(美國International Laboratory公司,批號365724),聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒(上海美旋生物公司),電子分析天平(德國Sartorius公司),離心機(jī)、恒溫水浴鍋(美國BioRad公司),多功能酶標(biāo)儀(美國Ther-mo公司)。

1.3模型建立 除10只為健康大鼠外,其余50只均依據(jù)文獻(xiàn)〔6〕使用卵清蛋白致敏法建立過敏性鼻炎模型。造模過程中將0.3 mg卵清蛋白、300 mg氫氧化鋁粉末及1 ml生理鹽水共同混合配制成懸液后,注入大鼠腹腔內(nèi),1次/d、2 g/L進(jìn)行為期20 d的基礎(chǔ)致敏,另加上卵清蛋白生理鹽水向鼻腔中滴加1次/d,10 μm/次,共計1 w。在最后1次對大進(jìn)行致敏后的1 h內(nèi)使用量化疊加計分法進(jìn)行計分,當(dāng)大鼠少量接觸鼻部且噴嚏數(shù)低于3次為1分,當(dāng)大鼠數(shù)次觸碰鼻部且噴嚏次數(shù)在9次內(nèi)為2分,當(dāng)大鼠接觸鼻部十分頻繁且噴嚏次數(shù)超過9次為3分,且分值超過5則為AR大鼠建模成功,本次參與建模實驗的大鼠均建模成功。

1.4分組給藥 將大鼠分為健康(A)組、模型(B)組、玉屏風(fēng)顆粒低劑量(C低)組、玉屏風(fēng)顆粒中劑量(C中)組、玉屏風(fēng)顆粒高劑量(C高)組、氯雷他定(D)組,各10只。C高、中、低組采用5.40、2.70、1.35 g/kg灌胃,氯雷他定組以0.90 mg/kg灌胃,A組和B組給予等量生理鹽水灌胃,均連續(xù)干預(yù)30 d。

1.5ELISA檢測血清TNF-α、IL-4、IgE、HIS水平 采集大鼠尾靜脈血液樣本0.5 ml,置于1.0 ml經(jīng)4%乙二胺四乙酸(EDTA)鈉鹽溶液處理的試管中,以3 000 r/min離心5 min,分離血漿,用ELISA法檢測血漿中IL-4、HIS、IgE、TNF-α水平,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 將大鼠經(jīng)10%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔麻醉后采用脫臼法將其處死,剔除上頜骨部分的組織,并將其分離,把鼻背從中間進(jìn)行切開,將鼻中隔機(jī)器兩側(cè)的鼻腔露在外部,鼻中隔及其鼻黏膜組織進(jìn)行有序剝離,采集雙側(cè)鼻黏膜組織,放在10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織。

1.7鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)檢測 行HE染色后,在顯微鏡下選擇5個視野(面積675.2 mm×498 mm)以細(xì)胞有分葉核及細(xì)胞質(zhì)中有嗜酸性顆粒為標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行EOS計數(shù),5個/張病理切片,1個EOS為1個計數(shù)。

1.8Western印跡檢測C-Fos、C-Jun蛋白 取大鼠鼻黏膜組織1 g進(jìn)行勻漿裂解,TIP管吸打,冷存靜置30 min,轉(zhuǎn)移至離心管5 ℃,10 000 r/min離心30 min,取上清液凍存,測定蛋白含量,取總蛋白,高溫變性,電泳,C-Fos轉(zhuǎn)膜40 min,C-Jun轉(zhuǎn)膜15 min,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗C-Fos(1∶1 000)、C-Jun(1∶500),β-actin(1∶2 000)5 ℃孵育過夜,TBST液洗膜,HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗滌,曝光顯影,用ImageJ軟件分析圖像,以β-actin為內(nèi)參,相應(yīng)蛋白條帶灰度值/β-actin表示C-Fos、C-Jun相對表達(dá)量。

1.9反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測白三烯受體(CysLT1-R)和CysLT2-R基因mRNA的表達(dá) 取大鼠鼻黏膜組織,用Trizol試劑提取總RNA,制成勻漿后加100 μl氯仿,搖勻后低速離心15 min,洗滌后提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄后取得互補DNA,以β-actin為內(nèi)參,用RT-PCR分別擴(kuò)增CysLT1-R、CysLT2-R基因,設(shè)置反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為80 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,75 ℃ 延伸30 s,共40個循環(huán)。基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)。CysLT1正向：5′-TCTCCGTTTGTGGGTTTCT-3′,反向：5′-TATAAGGC ATAGGTGGTG-3′;CysLT2正向：5′-AG CGTTAGGCATAAAGGGT-3′,反向：5′-CAAGTGTAGTAGGCTAG TA-3′;β-actin正向：5′-CCTACCATTGACGGTGATGC-3′,反向：5′-TACGGTCTTAATCTTCGAATC-3′。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組鼻黏膜病理組織HE染色 A組鼻黏膜結(jié)構(gòu)及組織生長良好,無EOS血管浸潤、血腫等不良反應(yīng);B組與C低組鼻黏膜內(nèi)部組織伴有明顯大量EOS浸潤產(chǎn)生及黏膜上皮損傷脫落,黏膜下腺體增生和血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象;C中組與D組鼻黏膜仍有部分腫脹及嗜酸性粒細(xì)胞,仍有炎性浸潤現(xiàn)象;C高組鼻腔黏膜中仍有少量水腫和輕度血管擴(kuò)張現(xiàn)象,且EOS浸潤明顯降低,見圖1。

圖1 各組鼻黏膜病理組織(HE染色,×200)

2.2各組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平 與A組相比,B組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平明顯增高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05);與C中組相比,C高組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)。與C高組比較,D組上述指標(biāo)明顯增高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組比較無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 各組血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平及鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞表達(dá)比較

2.3各組鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞 與A組比較,B組鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞明顯增多(P<0.05);與B組比較,C中組鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞明顯減少(P<0.05);與C中組比較,C高組鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞明顯減少(P<0.05);與C高組比較,D組鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞明顯增多(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.4各組鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2受體mRNA表達(dá) 與A組比較,B組鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05);與C中組比較,C高組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05);與C高組比較,D組上述指標(biāo)明顯增高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表2。

表2 各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白及CysLT1和CysLT2 mRNA表達(dá)比較

2.5各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達(dá) 與A組比較,B組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與B組比較,C中組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05);與C中組比較,C高組上述指標(biāo)表達(dá)明顯降低(P<0.05);與C高組比較,D組上述指標(biāo)明顯升高(P<0.05);B組與C低組無明顯差異(P>0.05),C中組與D組無明顯差異(P>0.05),見表2、圖2。

圖2 各組鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達(dá)

3 討 論

AR的產(chǎn)生常表現(xiàn)為呼吸區(qū)的鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,包括細(xì)胞外基質(zhì)的不斷聚積、杯狀細(xì)胞生化、黏膜纖毛上皮細(xì)胞和血管新生被破壞及黏膜下腺體增生等〔7〕。中醫(yī)認(rèn)為,AR是由臟腑虛虧、風(fēng)寒入體、正邪互克、肺氣阻塞、津水停聚、犯及鼻竅阻塞所致〔8〕。中藥玉屏風(fēng)顆粒具有固表養(yǎng)氣,祛邪祛風(fēng)等功效,臨床治療中常用于流感、免疫調(diào)節(jié)及反復(fù)性過敏病癥等〔9〕。

研究發(fā)現(xiàn),炎癥遞質(zhì)引發(fā)的免疫細(xì)胞合成、釋放及分解均參與了AR的發(fā)生發(fā)展〔10〕。本研究提示,玉屏風(fēng)顆粒對AR大鼠血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS等具有一定抑制作用。目前認(rèn)為,AR的產(chǎn)生是由致敏原接觸機(jī)體導(dǎo)致的,且由IgE所引發(fā)的HIS及纖維蛋白溶酶等相關(guān)介質(zhì)大量釋放而引起的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),在過程中通過與多種免疫因子相結(jié)合而引發(fā)噴嚏、流涕等鼻炎反應(yīng)〔11〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),西藥氯雷他定作為長效三環(huán)類抗HIS藥物,具有起效快、療效較持久等特點,但停藥后疾病的復(fù)發(fā)率較高〔12〕。玉屏風(fēng)顆?？赏ㄟ^發(fā)揮中藥黃芪、白術(shù)等成分對免疫的雙向調(diào)節(jié)作用,在AR的治療中通過抑制炎癥釋放,改善由于炎性遞質(zhì)傳遞所導(dǎo)致的毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增加等引起的多種過敏反應(yīng),從而改善機(jī)體的致敏狀態(tài),在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮疾病調(diào)節(jié)作用〔13〕。

EOS是AR中的炎癥細(xì)胞,也是重要的炎癥指標(biāo),在變態(tài)反應(yīng)中EOS會產(chǎn)生脫顆?，F(xiàn)象,并通過釋放大量趨化因子和炎性細(xì)胞進(jìn)而加重疾病反應(yīng)。本研究提示,玉屏風(fēng)顆粒對抑制AR大鼠鼻黏膜組織中EOS細(xì)胞活化具有積極作用。以往研究發(fā)現(xiàn),在AR的發(fā)生過程中,EOS趨化因子使得血液中的炎性因子大量聚合,致使鼻腔中產(chǎn)生較多的分泌物及EOS細(xì)胞,并在炎性因子活化、細(xì)胞黏附、移行及趨化的同時擴(kuò)張鼻黏膜血管,使機(jī)體處于致敏狀態(tài)并增加局部組織水腫〔14〕。中醫(yī)將AR歸為“鼻衄”范疇,其病理反應(yīng)為肺部虛薄、氣虛不受、鼻損入竅,進(jìn)而使得肺腑失固、竅內(nèi)酸塞。因此,對于AR的治療應(yīng)以補正固衛(wèi)、益氣祛邪為主〔15〕。玉屏風(fēng)顆粒中的防風(fēng)、白芍、辛夷等可通過發(fā)揮抑制組胺和抗過敏介質(zhì)、收縮鼻腔內(nèi)血管黏膜及抑制肥大細(xì)胞脫顆粒等作用,繼而發(fā)揮AR的治療作用。續(xù)艷等〔16〕在研究中發(fā)現(xiàn),防風(fēng)、白芍可顯著降低AR大鼠鼻分泌物EOS數(shù)量?？梢娫贏R治療中,玉屏風(fēng)顆粒相關(guān)中藥成分抑制B細(xì)胞合成過敏原特異性免疫球蛋白,緩解副交感神經(jīng)興奮導(dǎo)致的腺體分泌、黏膜充血的同時,阻斷免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子所致的EOS惡性增長和鼻黏膜炎性反應(yīng)。

以往研究發(fā)現(xiàn),CysLTl、CysLT2受體對增加血管通透性,增強心肌缺血再灌注損傷等具有關(guān)鍵作用,并可參與包括鼻咽炎等呼吸系統(tǒng)炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過程之中。本研究提示,玉屏風(fēng)顆粒對抑制AR大鼠鼻黏膜組織中CysLT1和CysLT2 mRNA增長具有積極作用。相關(guān)研究表示,當(dāng)機(jī)體與變應(yīng)原接觸時可誘導(dǎo)鼻腔區(qū)域的EOS及肥大細(xì)胞脫顆?；罨?并通過釋放白三烯等炎性介質(zhì)對鼻黏膜的感覺神經(jīng)末梢及興奮副交感神經(jīng)等產(chǎn)生刺激,引起鼻癢、流涕及噴嚏頻繁等過敏反應(yīng)〔17〕。李泳文等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),玉屏風(fēng)顆粒在抑制過敏原特異性IgE合成的同時也阻斷了白三烯、前列腺素及Th2 細(xì)胞因子等多種炎性介質(zhì)的進(jìn)入從而降低鼻塞、流涕等過敏反應(yīng)。氯雷他定雖也能在一定程度上降低HIS H1受體和肥大細(xì)胞等釋放白三烯,但其作用效果仍低于玉屏風(fēng)顆粒。

C-Fos、C-Jun為早期的即刻反應(yīng)基因,能夠參與有關(guān)基因的調(diào)控和疾病的表達(dá),且C-Fos蛋白并不能直接與DNA相結(jié)合,而是與C-Jun聯(lián)合構(gòu)成異二聚體發(fā)揮效用。本研究提示,玉屏風(fēng)顆?？赡軐档虯R大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun蛋白表達(dá)具有一定影響。Gui等〔19〕研究表示,藥物抗AR作用機(jī)制可能與AP-1、TNF-α等因素有關(guān)。在AR中TLR可能在受到病原體的刺激后,通過激活多個信號傳導(dǎo)通路及免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá),參與體內(nèi)炎癥及免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展〔20〕。黃芪可雙向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫、改善毛細(xì)血管通透性等功效發(fā)揮抗病毒和抑菌效用〔21〕。李承德〔22〕在相關(guān)研究中表示,黃芪能夠使大鼠海馬磷酸化的c-Fos和c-Jun水平顯著下降,并有改善炎癥因子的作用。推測玉屏風(fēng)顆粒治療AR可能是通過調(diào)節(jié)炎癥途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、生長因子等的分泌,增加血清中Ig含量,進(jìn)而在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮抑制AP-1及其下游因子的釋放和分泌IgE、IL-4、TNF-α等,起到解表祛風(fēng)、共利鼻竅等抑制疾病的作用。

綜上,玉屏風(fēng)顆粒對改善AR大鼠鼻黏膜組織重塑,調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答反應(yīng),降低促炎因子及白三烯水平的作用機(jī)制可能是通過TLR9/AP-1等來實現(xiàn)的。但對于C-Fos、C-Jun在組織重塑的具體效果仍有待進(jìn)一步研究。且在考慮藥物成本及有效性、安全性的同時,為達(dá)到臨床癥狀控制和改善病情反復(fù)的目的可以考慮使用玉屏風(fēng)顆粒。