李景 劉夢冉 田勝達 李文毅 夏世金 張宏利 李曉華

(1上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200137;2上海交通大學附屬同仁醫(yī)院虹橋國際醫(yī)學研究院;3復旦大學附屬華東醫(yī)院上海市老年醫(yī)學研究所)

流行病學調(diào)查顯示,我國成人糖尿病發(fā)病率為11.2%,老年人群糖尿病患病率超過20%〔1〕。胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的核心機制,導致胰島β細胞功能損傷的原因有多種,包括β細胞胰島素合成和分泌能力下降,增殖減少,凋亡增加,退分化增多等。其中β細胞退分化是近年發(fā)現(xiàn)的導致β細胞功能損傷的新機制〔2〕。生活方式干預是預防和治療2型糖尿病的基礎,熱量限制(CR)是目前較為有效的生活方式干預手段,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CR具有抗衰老的作用,而2型糖尿病也是常見的衰老相關性疾病。CR可通過減輕肥胖和胰島素抵抗改善糖尿病,也可通過改善胰島β細胞分泌功能,抑制β細胞凋亡,抗氧化應激,恢復β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子表達等機制改善胰島β細胞功能〔3〕。但其對β細胞退分化的影響目前仍不明確。本研究以db/db糖尿病小鼠為對象,探討CR對db/db小鼠糖代謝、胰島β 細胞功能及去分化的影響,為通過CR預防和治療2型糖尿病提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級3周齡雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量8～10 g共10只;SPF級3周齡雄性db/db小鼠,體質(zhì)量10～12 g共20只,購于南京集萃藥康生物科技公司,許可證號：scxk(蘇)2020-0004。室溫20～25 ℃,自由飲水,12 h/12 h晝夜明暗交替日光燈照明。動物使用及實驗設計均符合上海中醫(yī)藥大學實驗動物管理委員會的相關規(guī)定。

1.2實驗分組 C57BL/6J小鼠予自由進食,設定為C-FD組(n=10)。db/db小鼠隨機分為兩組,每組10只。其中一組db/db小鼠自由進食,設定為db-FD組,另一組CR予C-FD組60%飼料喂養(yǎng),設定為db-CR組。每周檢測體質(zhì)量、測空腹血糖1次至小鼠9周齡時共6 w實驗結束。

1.3主要試劑 小鼠普通飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司;血糖試紙和血糖儀購于羅氏公司;小鼠超敏胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于Crystal Chem公司;胰島素單克隆抗體購自invitrogin公司;胰腺十二指腸同源蛋白(Pdx)1、NK6同源框1(Nkx6.1)和叉頭盒(FOX)O1兔多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司; 乙醛脫氫酶家族1成員(ALDH1)A3兔多克隆抗體購自Millipore公司; 異硫氰酸熒光素(FITC)標記及四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的二抗購自Abcam公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福建邁新生物公司;伊紅染料購于上海碧云天有限公司;Ⅺ型膠原酶購自美國Sigma公司。

1.4糖耐量和胰島素耐量實驗 小鼠禁食12 h后,行糖耐量實驗,按照2 g/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射葡萄糖,并在0、15、30、60、120 min取血檢測血糖;小鼠禁食6 h后進行胰島素耐量試驗,按照0.75 IU/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射胰島素,并在0、15、30、45、60 min取血檢測血糖,以上實驗均采用尾靜脈取血,使用羅氏血糖儀測定血糖水平。

1.5胰島素含量測定 分離小鼠胰腺,加入8 ml酸化乙醇,勻漿后充分震蕩,置于搖床4 ℃過夜,離心取上清,測量溶液體積,使用ELISA測定胰島素水平。

1.6胰腺組織免疫組化和免疫熒光染色 小鼠胰腺組織分離后,固定包埋切片。切片脫蠟,水化,用檸檬酸抗原修復液修復后,一抗孵育(胰島素抗體1∶200)過夜后,加入過氧化物酶標記二抗,DAB顯色后,伊紅染色,封片后顯微鏡下采集圖片。免疫熒光雙染色,胰腺組織切片抗原修復后,一抗(胰島素抗體1∶200;Pdx1 1∶200;Nkx6.1 1∶100;FOXO1 1∶100;ALDH1A3 1∶50) 孵育過夜,FITC和TRITC標記的二抗室溫孵育1 h,封片后熒光顯微鏡下采集圖片。

1.7胰島分離 采用原位膠原酶灌注法進行分離,小鼠膽總管插管灌注0.5 mg/ml Ⅺ型膠原酶溶液,分離胰腺,37 ℃水浴消化,過篩后,體式顯微鏡下手工挑選,保存在-80 ℃冰箱待測。

1.8RNA-seq分析 分離的小鼠胰島進行 RNA 抽提,建庫,利用 Illumina Hiseq 測序儀上機測序,測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估采用軟件 FastQC(版本0.10.1)進行分析,對低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)過濾采用軟件Cutadapt(版本1.9.1),參考序列的比對分析采用軟件 Hisat2(版本2.0.1)。 以差異倍數(shù)(FC)≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01 作為標準,利用DESeq2進行樣品組間的差異表達分析,篩選差異表達基因。利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行通路富集分析。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1CR改善db/db小鼠體質(zhì)量、糖代謝和胰島素敏感性 3組實驗期間隨著周齡的增加體質(zhì)量逐漸增高,其中db-FD組體質(zhì)量增加明顯,2 w后db-FD組體質(zhì)量與C-FD和db-CR組相比均有明顯差異,而db-CR組體質(zhì)量在5 w時才較C-FD組明顯升高(P<0.05)。db-FD組從3 w開始空腹血糖水平較C-FD組明顯升高,而db-CR組從4 w開始較C-FD組空腹血糖水平顯著升高,db-CR組空腹血糖水平從4 w開始較db-FD組明顯降低(P<0.05)。糖耐量實驗顯示,db-CR組糖耐量曲線處于db-FD組與C-FD組之間,糖耐量較db-FD組明顯改善(P<0.05),胰島素耐量實驗顯示,db-CR組胰島敏感性(30 min后)較db-FD組明顯改善(P<0.05)。以上結果證實CR可改善db/db小鼠糖代謝。見表1～4。

表1 各組實驗期間每周體質(zhì)量

表2 各組實驗期間每周空腹血糖

表3 6 w后各組葡萄糖耐量實驗各時間點血糖結果和曲線下面積

表4 6 w后各組胰島素耐量實驗各時間點血糖自基線的變化及胰島素耐量實驗曲線下面積

2.2CR改善db/db小鼠胰島功能和形態(tài) 與C-FD組比較,db-CR和db-FD組空腹胰島素水平均明顯升高(P<0.05),這與空腹血糖水平結果一致。db-CR組空腹胰島素水平較db-FD組明顯升高(P<0.05),提示db-FD小鼠胰島功能受損。與C-FD組相比,db-FD和db-CR組胰島素含量均降低,但db-CR組胰島素含量較db-FD組明顯升高(P<0.05)。胰島免疫組化顯示,db-FD組胰島內(nèi)部結構松散,有較多的胰島素染色淡染區(qū),提示含有胰島素的β細胞減少,而db-CR組胰島結構明顯緊密,無明顯胰島素淡染區(qū)。以上結果提示CR可以改善胰島β細胞功能,增加db/db小鼠中胰島素陽性細胞的數(shù)目。見表5、圖1。

圖1 6 w后各組胰島切片(DAB,×400)

表5 6 w后各組空腹胰島素水平及胰腺胰島素含量

2.3db/db小鼠CR后胰島β細胞功能相關基因的RNA-seq分析 從主成分分析(PCA)圖中可發(fā)現(xiàn),3組胰島RNA表達具有明顯差異。見圖2。分別與db-FD組相比,C-FD組有1 320個基因表達改變,db-CR組有586個基因表達改變。其中262個基因為共同變化的基因。對此262個基因進行KEGG通路分析,結果顯示主要與胰腺分泌,蛋白消化吸收及核因子κB信號通路等有關。對胰島素分泌相關基因〔胰島素1,溶質(zhì)載體家族2成員(Slc2a)2,溶質(zhì)載體家族30成員(Slc30a)8,鉀內(nèi)向整流通道亞家族成員(Kcnj)11,葡萄糖激酶(Gck),胰高血糖素樣肽-1受體(Glp1r),突觸體相關蛋白(Snap)25〕,胰島β細胞特異轉(zhuǎn)錄因子〔Pdx1,神經(jīng)源分化因子(Neurod)1,肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(Mafa),Nkx6.1,NK2同源框2(Nkx2.2)〕,胰島β細胞分化和退分化相關基因〔神經(jīng)原蛋白(Neurog)3、FOXO1、Aldh1a3、嗜鉻粒蛋白(Chg)A、Y染色體性別解決定區(qū)盒轉(zhuǎn)錄因子(Sox)9、尿皮質(zhì)素(UCN)3〕在3組胰島中的表達進行分析,結果CR限制可逆轉(zhuǎn)db/db小鼠胰島中胰島素分泌相關基因(胰島素1、Slc2a2、Slc30a8、Kcnj11、Gck)表達的減少,提示CR改善了胰島β細胞功能。Pdx-1和Nkx6.1是胰島β細胞特異轉(zhuǎn)錄因子,被認定為胰島β細胞身份的標志,其表達水平降低,可能與胰島β細胞退分化有關。在RNN-seq分析中發(fā)現(xiàn),db-FD小鼠胰島中Pdx1和Nkx6.1表達降低,而CR上調(diào)其在db-CR組胰島中的表達。在胰島β細胞退分化相關基因方面,退分化的標志基因Aldh1a3和Sox9基因在db-FD小鼠胰島中較C-FD組表達升高,說明胰島β細胞存在退分化現(xiàn)象,CR后Aldh1a3和Sox9基因表達降低,提示胰島β細胞退分化改善。FOXO1是維持β細胞分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子,其在CR后表達升高,也提示胰島β細胞退分化改善。見圖3、圖4。

圖2 3組胰島RNA表達的PCA

圖3 C-FD組和db-CR組分別與db-FD組相比共表達差異基因KEGG通路

圖4 3組胰島素分泌基因、胰島β細胞特異轉(zhuǎn)錄因子和退分化相關基因的表達熱圖

2.4CR對db/db小鼠胰島β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子及退分化相關因子表達的影響 db-FD組胰島β細胞中Pdx1和Nkx6.1陽性細胞比例較C-FD組明顯降低,db-CR組胰島中Pdx1和Nkx6.1陽性細胞比例較db-FD組明顯升高(均P<0.05)。維持β細胞分化的FOXO1在db-FD組β細胞核中表達較C-FD組明顯降低,db-CR組FOXO1較db-FDX組表達明顯升高(P<0.05)。β細胞去分化標志分子Aldh1a3在db-FD小鼠胰島中表達升高,而在db-CR小鼠中表達降低。見圖5、表6。以上結果也證實在db/db小鼠胰島β細胞中發(fā)生退分化現(xiàn)象,而通過CR可改善胰島β細胞退分化,改善胰島β細胞功能。

圖5 6 w后β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和退分化相關蛋白的表達比較(免疫熒光染色,×400)

表6 6 w后各組胰島中Pdx1、Nkx6.1、FOXO1和胰島素雙陽性細胞比例

3 討 論

生活方式干預包括CR,是預防和治療2型糖尿病的重要手段之一〔3〕。相對于藥物,CR具有副作用小,安全性高的特點,對于老年2型糖尿病特別是伴發(fā)病較多,服用多種藥物治療的患者,通過CR減少糖尿病藥物的攝入,會有更多獲益。同時2型糖尿病本身也是衰老性疾病,CR在抗衰老方面也具有重要作用,本研究提示,CR后小鼠胰島β細胞退分化狀態(tài)改善。

飲食控制和加強運動等生活方式干預不僅是預防糖尿病的手段也是糖尿病治療的基礎。其中CR是飲食干預的一種方式,CR一般指的是為未進行飲食干預模型的50%～75%且而不發(fā)生營養(yǎng)不良的飲食干預方法〔4〕。CR在延長壽命、緩解炎性衰老和調(diào)控生物節(jié)律等方面發(fā)揮著重要作用,現(xiàn)有研究也證實,CR是一種有效的2型糖尿病干預方式〔5,6〕。通過CR可以降低2型糖尿病患者的空腹血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平,對于短病程肥胖的2型糖尿病進行短期的CR甚至可以達到糖尿病緩解〔7～9〕。本研究也證實,CR可改善糖尿病小鼠的糖代謝水平。CR改善糖尿病的機制一方面是通過減輕減少脂肪堆積,減輕體質(zhì)量,減少肝糖輸出和改善機體的胰島素敏感性〔10,11〕;另一方面是通過改善胰島β細胞功能和增加β細胞量〔12〕,但具體機制目前仍未完全闡明。研究證實,CR可以提高胰島素第一時相分泌〔13〕,在動物研究中發(fā)現(xiàn)給予ZDF大鼠CR后,可以提高葡萄糖刺激的胰島素分泌〔14〕。db/db小鼠CR后β細胞凋亡和氧化應激減少,延緩了小鼠胰島β細胞功能的喪失和β細胞量降低〔15〕。在飲食誘導的肥胖小鼠中發(fā)現(xiàn),CR可通過上調(diào)自噬通路改善β細胞的功能受損〔16〕。也有研究發(fā)現(xiàn),CR可促進糖尿病小鼠胰島β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Pdx1,MafA等表達〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn),CR減少了db/db小鼠胰島β細胞的退分化,完善CR改善β細胞功能的機制。

胰島β細胞退分化是近年研究發(fā)現(xiàn)的導致胰島β細胞功能減退的新機制。其主要表現(xiàn)在血糖升高等因素導致β細胞功能蛋白或身份蛋白表達變化,分化成熟的正常β細胞失去成熟細胞的特征,進而喪失部分或全部胰島素分泌能力〔18〕。有研究發(fā)現(xiàn),在2型糖尿病患者和動物模型中均能觀察到β細胞退分化的現(xiàn)象〔2,19,20〕。如Cinti等〔19〕通過研究β細胞特異轉(zhuǎn)錄因子的表達變化,證實人類糖尿病患者胰島β細胞存在去分化現(xiàn)象。Talchai等〔2〕在2 型糖尿病小鼠模型的胰島中,觀測到胰島素染色陰性和嗜鉻粒蛋白A(內(nèi)分泌前體細胞的標志物)染色陽性的細胞,并通過細胞譜系示蹤證實β細胞發(fā)生了退分化。β細胞發(fā)生退分化時與其功能和成熟相關的轉(zhuǎn)錄因子如MafA,Pdx1,Nkx6.1等表達降低,前體細胞標記蛋白Aldh1a3表達升高。本研究也得到類似結論。同時也有研究發(fā)現(xiàn),FOXO1是維持 β 細胞成熟和身份的關鍵轉(zhuǎn)錄因子,FOXO1 缺失的β細胞中出現(xiàn)內(nèi)分泌前體標志基因(Ngn3)表達,β細胞的標志基因(Mafa)和胰島素表達明顯降低,β細胞出現(xiàn)退分化現(xiàn)象〔2〕,目前研究還發(fā)現(xiàn),退分化的過程是可逆的,當解除高血糖狀態(tài)后,退分化的β細胞可再分化為成熟β細胞〔21〕。故尋找減少β細胞退分化或促進再分化的方法也是目前糖尿病治療研究的熱點,本研究結果為相關研究提供了一定實驗基礎。同時,本研究仍存在一定缺陷。首先,本文是通過β細胞特異轉(zhuǎn)錄因子、前體細胞標記蛋白及退分化相關蛋白等的表達變化評估β細胞退分化的狀態(tài),雖然此方法簡單易行,在其他研究中也廣泛采用,但是基于Cre/loxp系統(tǒng)的細胞譜系示蹤才是判斷退分化的金標準,因為小鼠模型的限制本研究未進行相關實驗。其次,本文僅研究了CR在db/db小鼠中的作用,對于其他糖尿病模型例如高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病模型,ZDF大鼠模型未進行研究,同時CR是否對人類2型糖尿病患者的胰島具有同樣的減少去分化的作用也需探討。在接下來的實驗中,將完善相關研究,為CR飲食改善胰島β細胞功能機制的闡明提供更有力證據(jù)。