董琦 錢(qián)紅月 廖可欣 熊浩仲 侯吉華 肖移生

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,江西 南昌 330004)

隨著世界人口老齡化不斷加劇,阿爾茨海默病(AD)的患病率持續(xù)升高;到2050年,全球AD患病率將是目前的2倍,而根據(jù)AD的生物學(xué)定義,這一估計(jì)將高出3倍,這已嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)健康〔1〕。AD是一種多因素、復(fù)雜的中樞神經(jīng)退行性病變,目前已有的治療藥物雖能緩解其癥狀,但大都無(wú)法補(bǔ)充大腦內(nèi)過(guò)多丟失的神經(jīng)元;針對(duì)此病,尚無(wú)有效和穩(wěn)定的治療策略〔2〕。因此,尋找有效藥物促進(jìn)大腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖以補(bǔ)充、替代丟失的神經(jīng)元,是目前AD研究的重點(diǎn)方向之一〔3,4〕。

前期筆者對(duì)黃精-當(dāng)歸配伍(CPA)之黃精丸抗AD進(jìn)行了較深入的研究,臨床應(yīng)用表明該丸治療輕中度AD療效較好,可改善患者癡呆癥狀〔5〕;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明CPA具有治療大、小鼠AD作用,能激活A(yù)D動(dòng)物腦內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路〔6～8〕。但CPA激活該信號(hào)通路與其抗AD確切機(jī)制之間的內(nèi)在聯(lián)系有待深入闡明。研究表明,體內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)中樞神經(jīng)影響亦顯著,如激活A(yù)D動(dòng)物腦內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)則可促進(jìn)海馬齒狀回(DG)區(qū)內(nèi)NSCs增殖〔9,10〕。提示CPA可促進(jìn)AD動(dòng)物海馬NSCs增殖以發(fā)揮抗AD作用?；诖?本文從該信號(hào)通路角度觀察CPA對(duì)AD小鼠海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)、2月齡、雄性、KM小鼠64只,購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心〔SYXK(贛)2017-0004〕,體質(zhì)量(26±2)g。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分成正常對(duì)照組、AD模型組、CPA組、CPA+苯甲酰胺化合物(IWR-1-endo)組(簡(jiǎn)稱(chēng)IWR-1-endo組),每組16只。

1.2藥物與主要試劑 CPA由黃精與當(dāng)歸按1∶1組成,2味中藥均購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬中醫(yī)院中藥房,試驗(yàn)藥液制備按課題組常用的中藥提取方法進(jìn)行,每1 ml試驗(yàn)藥液終濃度相當(dāng)于含中藥1 g〔6～8,11〕。Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1-endo及東莨菪堿均為Sigma公司產(chǎn)品,D-半乳糖為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)凍干粉為Med Chen Express公司產(chǎn)品,兔抗鼠β-catenin抗體、糖原合成激酶(GSK)-3β抗體、BrdU抗體、羊抗兔四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及熒光封固劑(Fluoroshield Mounting)均為Abcam公司產(chǎn)品,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑及免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品,即用型DAPI染液為北京Solarbio公司產(chǎn)品,trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品,蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒均為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器 EX-TE-03小型中藥提取罐為上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司產(chǎn)品,STRIKE 300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為德國(guó)ChemTron公司產(chǎn)品,DT-200型小鼠跳臺(tái)儀為上海康為醫(yī)療公司產(chǎn)品,EEP102型多功能電泳儀為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品,ABI7500型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品,BX-41型顯微數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)為日本Olympus公司產(chǎn)品,Motic Image Advanced3.2圖像數(shù)據(jù)分析軟件為德國(guó)Motic公司產(chǎn)品。

1.4AD模型建立與試驗(yàn)藥物干預(yù) AD模型組、CPA組、IWR-1-endo組小鼠頸背部皮下注射無(wú)菌生理鹽水配制而成的1% D-半乳糖液〔140 mg/(kg·d)〕,連續(xù)注射3 w以造成小鼠亞急性衰老;第4周開(kāi)始改用東莨菪堿〔2 mg/(kg·d)〕腹腔注射,連續(xù)注射2 w以造成小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙,模擬AD病變〔7,12,13〕。AD造模1 w后,同時(shí)以2.5 g/(kg·d)劑量給CPA組及IWR-1-endo組小鼠灌胃CPA,同時(shí)點(diǎn)給AD模型組灌胃0.5 ml/d無(wú)菌生理鹽水,共持續(xù)4 w。正常對(duì)照組僅日常飼養(yǎng),不做灌胃處理。參考文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠IWR-1-endo給藥方法〔14,15〕,在灌胃給藥的同時(shí)給予IWR-1-endo組小鼠腹腔注射0.5 mg/ml的IWR-1-endo溶液(按0.1 ml/10 g劑量進(jìn)行注射,1次/2 d),共持續(xù)4 w。第5周開(kāi)始,對(duì)所有小鼠再增加腹腔注射BrdU標(biāo)記處理〔50 mg/(kg·d)〕,連續(xù)5 d〔16〕。

1.5跳臺(tái)檢測(cè) 檢測(cè)裝置內(nèi)有6個(gè)不透光的回避反射間,每間中央有一個(gè)高、直徑均為3.5 cm的圓形絕緣平臺(tái),底面鋪有可通36 V交流電的銅柵;實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠置于底面,接電后小鼠受電擊的正常反應(yīng)是跳上絕緣平臺(tái),多數(shù)小鼠有可能再次或多次跳下平臺(tái)而受電擊又會(huì)迅速跳回平臺(tái);按此法訓(xùn)練各小鼠5 min,并分別記錄小鼠受到電擊的反應(yīng)時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)以此作為其學(xué)習(xí)成績(jī);24 h后重復(fù)檢測(cè),先將小鼠放在平臺(tái)上,記錄其第1次跳離平臺(tái)的潛伏時(shí)間及5 min內(nèi)反復(fù)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)以此檢測(cè)小鼠的記憶成績(jī),若5 min內(nèi)小鼠不離開(kāi)平臺(tái),則潛伏期計(jì)為300 s〔7,11〕。

1.6取材 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后次日,每組隨機(jī)取8只小鼠行快速脫頸處死,快速取出大腦海馬,漂洗后勻漿于液氮凍存待檢;每組其余小鼠作灌注固定后取腦、再固定、制作切片用于各形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.7RT-qPCR檢測(cè) 參照trizol試劑說(shuō)明書(shū),提取各組小鼠海馬勻漿的總RNA,按課題組方法進(jìn)行RT-qPCR〔7,8,11～13〕。待測(cè)基因擴(kuò)增引物序列由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成,β-catenin上游引物5′-AAGGTAGAGTGATGAAAGTTGTT-3′,下游5′-CACCATGTCCTCTGTCTATTC-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp;GSK-3β上游引物5′-CCGCCCGGCTAACACCACTG-3′,下游5′-GTGCTGGTCTTTCCCGCGCA-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度326 bp;GAPDH內(nèi)參引物上游5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′,下游5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。應(yīng)用ABI7500 PCR儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組模板Ct值,陰性對(duì)照以RNA酶水(RNAse-free H2O)為模板,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,55～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán);對(duì)所獲得的Ct值進(jìn)行相對(duì)定量分析,以倍比(Folds)=2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct GAPDH)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct GAPDH)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值。

1.8Western印跡檢測(cè) 用蛋白提取試劑盒提取各小鼠海馬勻漿的總蛋白,以BCA法定量蛋白。取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加β-catenin、GSK-3β一抗(1∶500),以GAPDH為內(nèi)參,4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫1 h,用化學(xué)發(fā)光液在暗室內(nèi)顯影、曝光成像,在化學(xué)發(fā)光儀上分析結(jié)果并進(jìn)行圖像采集。

1.9BrdU免疫組化 操作步驟按試劑盒推薦的鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)法步驟進(jìn)行,BrdU以1∶500稀釋。每張切片的左右對(duì)稱(chēng)海馬同步檢測(cè),計(jì)數(shù)海馬DG區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：于400倍光鏡下,隨機(jī)取相鄰3個(gè)視野,運(yùn)用Motic數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,結(jié)果取平均值。

1.10BrdU免疫熒光 切片經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后滴加5%山羊血清封閉,然后滴加兔抗小鼠BrdU(1∶500)抗體,再滴加山羊抗兔TRITC二抗,漂洗后封片。同BrdU免疫組化的觀察、計(jì)數(shù)方法,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)海馬DG區(qū)的陽(yáng)性熒光細(xì)胞并采集圖片。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)差異比較 與正常對(duì)照組比較,AD模型組跳臺(tái)學(xué)習(xí)成績(jī)的反應(yīng)時(shí)間顯著延長(zhǎng),學(xué)習(xí)與記憶測(cè)試的錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多,記憶成績(jī)的潛伏時(shí)間顯著縮短(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組跳臺(tái)學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少,跳臺(tái)記憶的潛伏時(shí)間明顯增加(P<0.01),表明其學(xué)習(xí)及記憶成績(jī)明顯提高、癡呆癥狀顯著改善;與CPA組比較,IWR-1-endo組跳臺(tái)學(xué)習(xí)成績(jī)的反應(yīng)時(shí)間顯著延長(zhǎng),學(xué)習(xí)與記憶測(cè)試的錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多,記憶成績(jī)的潛伏時(shí)間顯著縮短(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)、海馬神經(jīng)β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)水平、海馬DG區(qū)BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較

2.2各組海馬DG區(qū)BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較 與正常對(duì)照組比較,AD模型組海馬DG區(qū)BrdU免疫組化及免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組海馬DG區(qū)BrdU免疫組化及免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均明顯增多(P<0.01);與CPA組比較,IWR-1-endo組海馬DG區(qū)BrdU免疫組化及免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組海馬DG區(qū)BrdU(×400,箭頭指示陽(yáng)性細(xì)胞)

2.3各組海馬神經(jīng)β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較,AD模型組海馬β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達(dá)水平分別顯著降低和升高(P<0.01);與AD模型組比較,CPA組β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達(dá)水平分別顯著升高和降低(P<0.01);與CPA組比較,IWR-1-endo組β-catenin、GSK-3β mRNA及蛋白的表達(dá)水平分別顯著降低和升高(P<0.01)。見(jiàn)表1、表2、圖2。

1～4：正常對(duì)照組、AD模型組、CPA組、IWR-1-endo組圖2 各組海馬神經(jīng)β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)

表2 各組海馬神經(jīng)β-catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

AD為中醫(yī)“呆病”范疇的一種常見(jiàn)類(lèi)型,其實(shí)質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)之病癥,本虛為腎虛精虧、氣虛髓衰兼有陰虛血虛,標(biāo)實(shí)為血瘀絡(luò)滯、痰濁互結(jié)則腦脈痹阻。該病可因虛致實(shí),也可由實(shí)致虛,虛實(shí)夾雜,最終導(dǎo)致髓海不足,發(fā)為癡呆。因此,腎精虧虛和血瘀絡(luò)滯是AD的核心病機(jī),貫穿其發(fā)病的全過(guò)程。針對(duì)此核心病機(jī),中醫(yī)防治癡呆主要采取補(bǔ)腎填精、活血通絡(luò)等標(biāo)本同治措施以生髓養(yǎng)腦、充盈髓?！?7,18〕。黃精丸又稱(chēng)九轉(zhuǎn)黃精丸,為古代皇家常用藥品之一,由黃精、當(dāng)歸以1∶1配伍后經(jīng)蜜制成丸,具有補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)、化痰清濁等功效,供宮廷防癡抗衰、保健養(yǎng)生使用,為補(bǔ)益之佳品〔19〕。黃精丸在防治AD等老年性疾病中顯示出神經(jīng)保護(hù)功能,具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

AD與Wnt相關(guān)信號(hào)通路,尤其是與Wnt/β-catenin信號(hào)有著密切的聯(lián)系,該通路中相關(guān)蛋白可通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于神經(jīng)細(xì)胞膜,從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,可顯著改善AD動(dòng)物的癡呆癥狀〔20,21〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CPA能升高AD小鼠海馬神經(jīng)Wnt、蓬松蛋白(DVL)2、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1等關(guān)鍵因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平,這表明其可激活A(yù)D小鼠海馬神經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抗AD作用〔7,8〕。本實(shí)驗(yàn)得出相似的結(jié)果,且采用IWR-1-endo抑制AD小鼠海馬神經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路后,CPA治療效果明顯降低,這進(jìn)一步證實(shí)了前期的研究結(jié)果。

研究表明,AD動(dòng)物腦內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)水平明顯降低,激活此信號(hào)則可以調(diào)控腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)育與存活,促進(jìn)海馬NSCs增殖、補(bǔ)充神經(jīng)元數(shù)量,進(jìn)而恢復(fù)海馬記憶認(rèn)知調(diào)節(jié)功能〔9,10〕。本研究結(jié)果提示,CPA可通過(guò)該信號(hào)通路促進(jìn)AD動(dòng)物海馬NSCs增殖;CPA能調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)AD動(dòng)物海馬NSCs增殖,從而恢復(fù)海馬功能、發(fā)揮抗AD作用的設(shè)想。

綜上所述,黃精丸具有防治AD的作用,并能促進(jìn)海馬NSCs增殖,其機(jī)制可能與其調(diào)控海馬神經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。