史翠娟 邵天瑞 吳深濤

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193;2天津中醫(yī)藥大學(xué))

糖尿病性下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(DLASO)是常見的2型糖尿病大血管并發(fā)癥,并隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而逐年增加,糖尿病每增加1年,其下肢血管病變可能性增加30%〔1〕,嚴(yán)重者可出現(xiàn)潰瘍或壞疽等癥狀,是致殘致死的主要原因〔2〕,全球每30 s就有一人因糖尿病而截肢〔3〕。糖尿病不僅容易出現(xiàn)嚴(yán)重大血管缺血性病變,而且側(cè)支血管形成代償能力嚴(yán)重不足,以致DLASO患者是非糖尿病患者截肢率的5倍。促進(jìn)血管再生,建立有效的側(cè)支循環(huán),不僅能夠改善下肢血管病變,還能相應(yīng)地改善心腦血管的供血,從而提高患者的生存質(zhì)量。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的前體細(xì)胞,主要參與血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)及新生血管的形成。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病屬于“脈痹”的范疇?！夺t(yī)林改錯(cuò)》記載：“元?dú)饧忍?必不能達(dá)于血管,血管之氣,必停留而瘀?！碧崾練馓撗鍪潜静〉幕静C(jī)。補(bǔ)陽還五湯作為益氣活血的代表方劑,在臨床上治療獲得了受肯定的療效。本研究通過觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)DLASO大鼠的一般情況、體質(zhì)量、血糖情況、腓腸肌重量、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子(PECAM-1,也稱CD31)、腓腸肌的α平滑肌肌動(dòng)蛋白(actin)、EPC表面標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和CD34的影響,探討補(bǔ)陽還五湯治療大鼠DLASO的新生血管生成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京) 2019-0008。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為空白對(duì)照組20只,構(gòu)建模型組40只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 鏈脲佐菌素(STZ,100 mg,Sigma,產(chǎn)品批號(hào)：s0130);補(bǔ)陽還五湯中藥湯劑由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。生黃芪 (產(chǎn)地：山西,批號(hào)：1912189)、地龍(產(chǎn)地：廣西,批號(hào)：2001147)、赤芍(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古,批號(hào)：1909004)、紅花(產(chǎn)地：新疆,批號(hào)：1908027)、川芎(產(chǎn)地：四川,批號(hào)：1911159)、當(dāng)歸(產(chǎn)地：甘肅,批號(hào)：1912115)、桃仁(產(chǎn)地：河北,批號(hào)：1909145)。

1.3模型制備與分組 空白對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng),構(gòu)建模型組高脂飼料喂養(yǎng)8 w后,第8周通過測(cè)試2 h的糖耐量來判斷大鼠胰島素抵抗,然后再以55 mg/kg STZ的劑量進(jìn)行腹腔注射,構(gòu)建糖尿病模型?？瞻讓?duì)照組大鼠尾靜脈注射同等劑量(25 mg/kg)檸檬酸鈉緩沖液。1 w后構(gòu)建模型,大鼠血糖>16.7 mmol/L則視為糖尿病模型大鼠構(gòu)建成功。糖尿病模型構(gòu)建成功后,將股動(dòng)脈根部結(jié)扎,然后剝離股動(dòng)脈3個(gè)分支并結(jié)扎,縫合,建立糖尿病下肢缺血模型。分為模型組20只,中藥干預(yù)組20只。

1.4干預(yù)方法 補(bǔ)陽還五湯(由生黃芪60 g,當(dāng)歸、赤芍、地龍、桃仁、紅花各9 g,川芎6 g組成),由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。灌胃按生藥11.5 ml/(kg·d)〔補(bǔ)陽還五湯處方整方藥物質(zhì)量111 g/d,人體質(zhì)量按照60 kg計(jì)算,藥物劑量按照與人體質(zhì)量換算,大鼠與人之間換算系數(shù)為6.25,大鼠用藥量為：6.25×111 g/60 kg=11.544 g/kg,為方便計(jì)算取劑量為11.5 g/(kg·d)灌胃,配成的中藥湯劑濃度為1 g/ml〕;空白對(duì)照組與模型組分別灌胃同等容量的生理鹽水,1次/d,連續(xù)4 w。每周取材1次,稱重后處死,取血,取左下肢腓腸肌稱重。

1.5檢測(cè)指標(biāo)與方法 ①大鼠一般狀況及體質(zhì)量。觀察大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)能力、進(jìn)食水、排尿、毛發(fā)光澤度、尾靜脈注射處有無感染等一般情況。用藥前后測(cè)量體質(zhì)量,并做好記錄。②大鼠血糖監(jiān)測(cè)。用藥前后通過大鼠目?jī)?nèi)眥取血,測(cè)量各組大鼠空腹血糖。③檢測(cè)大鼠腓腸肌重量。④免疫熒光染色評(píng)估缺血側(cè)腓腸肌新生血管密度。將分離的缺血側(cè)腓腸肌包埋制成石蠟切片,通過免疫熒光染色缺血側(cè)腓腸肌中的α-actin和CD31,進(jìn)一步評(píng)估缺血一側(cè)腓腸肌的新生血管密度。⑤對(duì)大鼠患側(cè)后肢腓腸肌進(jìn)行橫斷切片,VEGF、CD34免疫組織化學(xué)染色統(tǒng)計(jì)EPC的增殖情況。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 空白對(duì)照組精神良好,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)純白有光澤,飲水及尿量正常;模型組精神萎靡,毛色枯黃少光澤,反應(yīng)遲緩,飲水及尿量均明顯增加;中藥干預(yù)組與模型組比較精神狀態(tài)稍好轉(zhuǎn),毛色枯黃略有光澤,反應(yīng)較活躍,但飲水及尿量情況無明顯變化。

2.2各組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較 與空白對(duì)照組比較,模型組、中藥干預(yù)組體質(zhì)量均明顯下降(P<0.05),模型組、中藥干預(yù)組隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng),體質(zhì)量有所上升,見表1。

表1 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各組體質(zhì)量

2.3各組不同時(shí)間點(diǎn)血糖比較 與空白對(duì)照組比較,模型組、中藥干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)血糖升高(P<0.05,P<0.01),與模型組比較,中藥干預(yù)組給藥14、28 d后空腹血糖明顯降低(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各組空腹血糖

2.4各組不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌重量的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組給藥7、28 d后,中藥干預(yù)組給藥28 d后腓腸肌重量明顯下降(P<0.05,P<0.01)。模型組與中藥干預(yù)組,隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng),腓腸肌重量有上升趨勢(shì),見表3。

表3 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各組腓腸肌重量

2.5新生血管及α-actin、CD31表達(dá)情況 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,模型組血管新生數(shù)下降,且隨著天數(shù)的增加這一變化更加明顯;與模型組相比,中藥干預(yù)組左下肢缺血側(cè)腓腸肌組織中CD31、α-actin熒光表達(dá)量均增加,微血管數(shù)目明顯增多,管腔結(jié)構(gòu)也相對(duì)完整,說明給予補(bǔ)陽還五湯后,腓腸肌中的血管新生活躍,新生血管密度增加,且隨著用藥天數(shù)的延長(zhǎng)這一趨勢(shì)更加顯著,見圖1、圖2。

圖1 各組左下肢腓腸肌組織中CD31表達(dá)(免疫熒光,×400)

圖2 各組左下肢腓腸肌組織中α-actin表達(dá)(免疫熒光,×400)

2.6VEGF、CD34表達(dá)的差異 模型組患側(cè)的EPC數(shù)量較空白對(duì)照組明顯減少,表明糖尿病導(dǎo)致大鼠EPC數(shù)量下降,下肢血流恢復(fù)受損。而經(jīng)中藥分別灌胃7、14、21、28 d后,中藥干預(yù)組EPC數(shù)量逐漸增加,見圖3、圖4。

圖3 各組下肢肌組織VEGF蛋白表達(dá)(免疫組化,×400)

圖4 各組下肢肌組織CD34蛋白表達(dá)(免疫組化,×400)

3 討 論

相關(guān)研究表明,6.5%～50.0%的糖尿病患者可能會(huì)并發(fā)糖尿病下肢血管病變〔4,5〕。DLASO臨床表現(xiàn)以肢端發(fā)涼、肌肉萎縮、間歇性跛行、靜息痛,趾端麻木、針刺感、動(dòng)脈搏動(dòng)減弱或消失等癥狀為主,高血糖是其最主要的發(fā)病誘因,血管內(nèi)皮損傷是下肢缺血形成的重要因素。長(zhǎng)期高血糖患者的外周血中的血管內(nèi)皮組細(xì)胞數(shù)量減少,血管新生及損傷修復(fù)能力顯著下降,導(dǎo)致下肢血管病變的生成〔6〕。

一般情況下,非糖尿病外周血管疾病患者其側(cè)支循環(huán)的建立足以代償阻塞部位的血流喪失,但糖尿病患者因其側(cè)支血管新生能力受損而使心肌、肢端等靶器官嚴(yán)重缺血。傳統(tǒng)藥物、血管生長(zhǎng)因子治療,介入手術(shù)及外科手術(shù)等血運(yùn)重建在一定程度上改善了肢體供血緩解了臨床癥狀,但仍有部分患者無法實(shí)現(xiàn)再血管化,且有些治療存在一定的風(fēng)險(xiǎn),因此早期積極防治顯得尤為重要。糖尿病血管病變呈彌漫性,改善組織缺血區(qū)域血液灌注相對(duì)困難,通過形成新生動(dòng)脈血管改善缺血顯得尤為重要。EPCs主要來源于骨髓,在成人外周血中僅有少量存在,但是損傷血管修復(fù)及新生血管生成中發(fā)揮了重要作用〔7〕。一方面通過分泌VEGF等細(xì)胞因子,促進(jìn)缺血組織的血管新生,另一方面通過動(dòng)員、遷移、歸巢和分化參與損傷血管的再內(nèi)皮化和血管新生〔8〕。

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》,是中醫(yī)治療缺血性損傷的傳統(tǒng)名方,古代主要用于治療腦卒中所致的偏側(cè)肢體活動(dòng)不利,語言欠流利,口角流涎、大便秘結(jié)、小便頻數(shù)或遺尿不禁〔9〕;現(xiàn)代臨床廣泛用于治療腦梗死、冠心病等大血管病變及其他血管性栓塞疾病〔10〕。方中重用大劑量黃芪為君藥,大補(bǔ)脾胃元?dú)?氣為血之帥,補(bǔ)氣以行血,血行則瘀消絡(luò)通;當(dāng)歸養(yǎng)血活血,祛瘀而不傷血,為臣藥;桃仁、紅花、川芎、赤芍增強(qiáng)當(dāng)歸活血化瘀之力,地龍為蟲類藥,蟲咬善走竄,行散力強(qiáng),通經(jīng)活絡(luò)均為佐藥。諸味共用,標(biāo)本兼治,氣旺血行以治本,瘀消絡(luò)通以治標(biāo)。前期研究〔11,12〕證實(shí),補(bǔ)陽還五湯與常規(guī)治療相比,降糖調(diào)脂無差別,但其能明顯改善臨床癥狀,改善下肢血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),抑制血小板聚集,減少下肢動(dòng)脈血栓的形成,減少炎性因子釋放。進(jìn)而證實(shí)加味補(bǔ)陽還五湯明顯改善缺血癥狀,降低截肢率及術(shù)后再狹窄發(fā)生率,促進(jìn)血流恢復(fù)。黃芪提取物〔13〕可顯著提高動(dòng)脈粥樣硬化家兔外周血中EPCs的黏附、遷移及增殖能力;通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)而增強(qiáng)EPCs的血管生成能力。

本研究提示,DLASO大鼠存在精神萎靡、行動(dòng)活躍性下降、體質(zhì)量下降、腓腸肌肌肉萎縮,而補(bǔ)陽還五湯治療后能改善上述癥狀,增加體質(zhì)量及腓腸肌重量,對(duì)血糖有一定的改善作用;腓腸肌中的血管新生活躍,新生血管密度增加。EPC細(xì)胞難以直接檢測(cè),但其有表面標(biāo)志物。既往相關(guān)研究〔14〕顯示,早期的EPC表面主要表達(dá)CD133 、CD34及VEGF受體(VEGFR)-2及CD45,晚期EPC則主要表達(dá)CD133 、CD34及VEGFR-2〔14〕。EPC在分化成熟后的內(nèi)皮細(xì)胞中則不表達(dá)CD133〔15〕。

綜上,補(bǔ)陽還五湯能增加缺血下肢的EPC的生成,促進(jìn)缺血下肢的血管生成,從而改善DLASO大鼠的癥狀。