劉佩 李澤濛 賀小寧

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科,海南 ?？?570311)

口腔黏膜下纖維性變主要發(fā)病機(jī)制為黏膜硬化,形成條索,發(fā)病后多表現(xiàn)為固有層血管、纖維條索狀改變等,最終妨礙口腔功能發(fā)揮,現(xiàn)階段臨床多采用高壓氧、抗氧化劑、外源性酶類、糖皮質(zhì)激素等進(jìn)行治療,雖然可改善局部微循環(huán)、減輕細(xì)胞損傷、抑制膠原沉積等,但整體療效并不理想〔1～3〕。酪氨酸磷酸酶Z1型受體(PTPRZ1)是可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊的酪氨酸磷酸酶家族成員,其表達(dá)異?？梢l(fā)糖尿病、癌癥等〔4〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smad在多種纖維化疾病中均發(fā)揮著重要作用,可促進(jìn)纖維化形成〔5〕。本研究基于TGF-β/Smad信號通路探究調(diào)控PTPRZ1對口腔黏膜下纖維性變的干預(yù)效果。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取65只SPF級Wistar大鼠,體質(zhì)量220～260 g,由杭州拓實(shí)生物科技有限公司提供,動物許可證號：SYXK(浙)2020-0025,所有大鼠在相對濕度、室溫分別為50%、23 ℃的無病原菌籠子中進(jìn)行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng),參照動物試驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行本試驗(yàn)操作。

1.2PTPRZ1慢病毒載體構(gòu)建 LPL基因序列通過GenBanK查找序列獲得,構(gòu)建PTPRZ1過表達(dá)、沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成,并做慢病毒滴度測定(病毒滴度為1×109TU/ml)。

1.3分組與建模 在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后選取65只大鼠,10只為空白組,其余55只參照王宗康等〔6〕建立口腔黏膜下纖維性變模型。首先通過水合氯醛對建模大鼠進(jìn)行麻醉,麻醉完成后在大鼠兩側(cè)頰黏膜下注射100 μl檳榔提取物(成都德斯特生物公司提供),1次/d,連續(xù)注射8 w,以大鼠張口受限,口腔黏膜質(zhì)地變硬,顏色發(fā)白并形成條索狀為建模成功,55只建模大鼠最終有45只建模成功。將建模成功的45只大鼠分為模型組、上調(diào)組(10 μl PTPRZ1過表達(dá)慢病毒懸液)、下調(diào)組(10 μl PTPRZ1默慢病毒懸液)各15只,空白組、模型組注射同劑量的蒸餾水,1次/d,連續(xù)注射7 d后,觀察大鼠變化。

1.4大鼠一般情況觀察 對各組大鼠活動、形態(tài)、進(jìn)食、毛發(fā)光澤度等一般情況進(jìn)行觀察。

1.5病理學(xué)觀察 于PTPRZ1轉(zhuǎn)染7 d后,麻醉后將大鼠斷頸處死,取大鼠頰黏膜組織,用4%多聚甲醛固定24 h,通過梯度酒精脫水、石蠟包埋后將其切為5 μm厚薄片,烘干后脫蠟,采用梯度酒精、蒸餾水行水化及洗滌,之后使用蘇木素-伊紅(HE)染色,于光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器有限公司)下對大鼠頰黏膜組織病理形態(tài)變化進(jìn)行觀察。

1.6PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量檢測 于PTPRZ1轉(zhuǎn)染后,取大鼠頰黏膜組織,PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量通過實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)進(jìn)行鑒定,提取總RNA,將頰黏膜組織中的RNA使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動PCR儀。通過2-ΔΔCt方法計(jì)算出PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量。

1.7張口度檢測 于PTPRZ1轉(zhuǎn)染后處死前對各組張口度進(jìn)行檢測,首先對大鼠進(jìn)行麻醉,之后將上前牙進(jìn)行固定,通過計(jì)力器給予大鼠下前牙2 N力,使大鼠口腔充分打開,最后采用游標(biāo)卡尺對大鼠上下前牙垂直距離進(jìn)行檢測,共檢測3次,取平均值。

1.8頰黏膜評分 通過頰黏膜評分〔7〕對病情狀況進(jìn)行評估,內(nèi)容包括3項(xiàng)(口腔頰黏膜光滑度、纖維條索、色澤),單項(xiàng)分值為0～3分,得分越高表明病變越嚴(yán)重。

1.9膠原水平檢測 于PTPRZ1轉(zhuǎn)染后,取頰黏膜組織,加入適量(1∶10)組織蛋白抽離液,充分碾碎,以離心半徑3 cm,轉(zhuǎn)速3 000 r/min,離心10 min,提取上清液,70 ℃保存待測,各組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平采用通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行檢測。Ⅰ、Ⅲ型膠原 ELISA試劑盒由上海美軒生物科技有限公司提供。

1.10TGF-β/Smad信號通路蛋白相對表達(dá)量檢測 通過Western印跡檢測,組織中蛋白依照組織蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行萃取,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PDGE)于每孔加入80 μg蛋白后進(jìn)行,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉對PVDF膜進(jìn)行封閉,TGF-β1、Smad2、Smad3一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將TGF-β1、Smad2、Smad3二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學(xué)發(fā)光顯影采用電化學(xué)發(fā)光(ECL),以GAPDH為內(nèi)參,相對條帶灰度光密度值采用ImageJ軟件分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 空白組皮毛順滑、飲食正常,活動多,反應(yīng)靈敏,模型組活動少、體毛干枯缺少光澤,出現(xiàn)脫毛,食欲不振,畏寒蜷縮,上調(diào)組毛發(fā)枯黃雜亂,脫毛嚴(yán)重,食欲不振,反應(yīng)遲鈍,下調(diào)組食欲明顯提升,活動增加,體毛光澤度恢復(fù)。

2.2病理學(xué)特征對比 如圖1所示,空白組口腔頰黏膜上皮結(jié)構(gòu)正常,固有層下血管、肌纖維無明顯變化;模型組頰黏膜上層萎縮,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤;上調(diào)組口腔頰黏膜炎性細(xì)胞浸潤加重,固有層可見少量漿細(xì)胞;下調(diào)組口腔頰黏膜固有層上皮無明顯變化,炎性細(xì)胞明顯減少。

圖1 各組口腔頰黏膜病理學(xué)(HE染色,×200)

2.3各組PTPRZ1表達(dá)量 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組PTPRZ1表達(dá)量上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組PTPRZ1表達(dá)量上升,下調(diào)組PTPRZ1表達(dá)量下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組PTPRZ1表達(dá)量明顯下降(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染成功。

表1 各組PTPRZ1表達(dá)量、張口度、頰黏膜評分、膠原水平及TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量比較

2.4各組張口度、頰黏膜評分對比 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組張口度水平下降,頰黏膜評分上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組張口度水平下降,頰黏膜評分上升,下調(diào)組張口度水平上升,頰黏膜評分下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組張口度水平上升,頰黏膜評分下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組膠原水平對比 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平上升,下調(diào)組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.6各組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表達(dá)量 如表1、表2、圖2所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表達(dá)量上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組上述指標(biāo)上升,下調(diào)組上述指標(biāo)下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組上述指標(biāo)下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組TGF-β/Smad信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 各組TGF-β/Smad信號通路蛋白表達(dá)

3 討 論

口腔黏膜下纖維性變病程進(jìn)展緩慢、起病隱匿,頰、軟腭、舌、唇、咽為口腔黏膜下纖維性變的主要發(fā)病部位〔8〕?？谇火つは吕w維性變早期臨床癥狀并不明顯,隨著疾病的進(jìn)展可引發(fā)語言困難、張口受限、開口困難等影響患者正常生活的癥狀,因此及時(shí)有效治療對患者生活質(zhì)量提升具有重要意義〔9,10〕。

PTPRZ1是由一個碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域、一個纖維連接素結(jié)構(gòu)域、兩個胞質(zhì)酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域、硫酸軟骨素蛋白聚糖組成的單通道Ⅰ型膜蛋白,PTPRZ1異常表達(dá)與間變性大細(xì)胞淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等存在密切聯(lián)系,但關(guān)于其與口腔黏膜下纖維性變的相關(guān)研究較少〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)〔12,13〕,上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與口腔黏膜下纖維性變癌變聯(lián)系密切,而PTPRZ1可通過調(diào)控β-catenin表達(dá)抑制纖維化進(jìn)程,進(jìn)而阻礙了口腔黏膜下纖維性變癌變病情發(fā)展,與本文研究結(jié)果一致。表明沉默PTPRZ1可抑制口腔黏膜下纖維性變大鼠病情發(fā)展。

口腔黏膜下纖維性變病情發(fā)展過程中患者張口度水平不斷下降,因此張口度水平可反映病情嚴(yán)重程度〔14〕。頰黏膜評分可對口腔頰黏膜光滑度、纖維條索、色澤病變程度進(jìn)行評估,反映疾病進(jìn)展程度〔15〕。上皮下膠原過度積累為口腔黏膜下纖維性變發(fā)生癌變的主要原因之一,Ⅰ、Ⅲ型膠原水平升高可加重膠原蛋白過度沉積情況,推動纖維化進(jìn)程,進(jìn)而加重患者病情〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)〔17〕,PTPRZ1可激活依賴?yán)野彼崃姿峄?進(jìn)而對TGF-β/Smad信號通路起到抑制作用,使Ⅰ、Ⅲ型膠原等通路因子水平下降,抑制了膠原沉積,改善臨床癥狀,與本文研究結(jié)果一致。表明下調(diào)PTPRZ1可抑制口腔黏膜下纖維性變大鼠纖維化進(jìn)程,緩解其臨床癥狀。

TGF-β/Smad信號通路為典型促纖維化通路,其中TGF-β1可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等過程,且在多種器官、組織纖維化中TGF-β1發(fā)揮著重要作用,TGF-β1可刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌,進(jìn)而介導(dǎo)了纖維化〔18,19〕。TGF-β1結(jié)合膜受體后可使Smad2、Smad3激活,促進(jìn)其形成Smad2/Smad3/Smad4復(fù)合體,之后Smad2/Smad3/Smad4復(fù)合體可轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核中,促使Ⅰ、Ⅲ型膠原轉(zhuǎn)錄,推動了纖維化進(jìn)程〔20,21〕。本研究發(fā)現(xiàn),口腔黏膜下纖維性變大鼠經(jīng)下調(diào)PTPRZ1干預(yù)后TGF-β/Smad信號通路得到抑制,病情緩解。研究發(fā)現(xiàn)〔22,23〕,TGF-β1與β-catenin相互影響,TGF-β1表達(dá)隨β-catenin表達(dá)下降而下降,而PTPRZ1可抑制β-catenin表達(dá),進(jìn)而對TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)起到抑制作用,與本文研究結(jié)果一致。表明沉默PTPRZ1可抑制TGF-β/Smad信號通路,作用于纖維化過程,進(jìn)而改善大鼠臨床癥狀,抑制病情發(fā)展。

綜上,口腔黏膜下纖維性變發(fā)生后伴隨張口受限、膠原生成增加、纖維條索形成等表現(xiàn),經(jīng)沉默PTPRZ1干預(yù)后可改善上述情況,其機(jī)制可能與TGF-β/Smad信號通路被抑制有關(guān)。