董海亮 王文彪, 陸永莉 李輝 劉靜文 王沐榮

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453000; 2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是目前臨床上最普遍的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、滑膜炎及軟骨下骨重塑被認為是 KOA 發(fā)展的主要特征〔1～4〕。目前已知KOA是一個由炎癥和代謝因素組成的復(fù)雜的過程。抑制關(guān)節(jié)炎癥及軟骨細胞外基質(zhì)的降解是治療的關(guān)鍵〔5,6〕。而核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB長期以來被認為是一種炎癥促成通路,在調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程及軟骨代謝平衡方面起重要作用,已成為KOA 的治療靶點〔7〕。臨床上KOA治療指南一致推薦基于運動的療法,包括物理療法(PT),作為其有效性證據(jù)的核心組成部分〔8～11〕,其中被動運動因其實施簡單方便,效果可靠,無創(chuàng)無痛,受到醫(yī)患雙方的歡迎。然而關(guān)于被動運動的動物實驗研究甚少,其作用機制也不甚了解。因此,本研究擬觀察被動運動對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)的保護作用,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只成年健康雄性SD大鼠,平均體質(zhì)量(260±10)g,購于山東省實驗動物中心,實驗動物使用許可證編號〔scxk(魯)2020-0005〕,在使用前,所有動物都在(22±0.5)℃和 55%±5% 濕度的受控室中飼養(yǎng)至少1 w。 實驗方案努力減少實驗中使用的動物數(shù)量,并獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物實驗倫理委員會的批準,所有實驗于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生命科學研究中心進行。

1.2造模 按隨機數(shù)字表法抽取10只作為空白對照組,其余大鼠給予10%水合氯醛(0.34 ml/100 g)腹腔麻醉,用改良Hulth法誘導KOA模型〔12〕,右后肢用電動剃須刀剃毛,用75%醫(yī)用酒精清洗。沿著膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)邊緣垂直切開髕骨周圍的皮膚,暴露關(guān)節(jié)囊并打開,髕骨外側(cè)移位并屈曲膝關(guān)節(jié)以暴露前交叉韌帶。隨后,用手術(shù)剪刀剪斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶,摘除內(nèi)側(cè)半月板而不損傷脛骨軟骨。用生理鹽水反復(fù)沖洗關(guān)節(jié)腔,徹底止血,之后滴入少量青霉素溶液預(yù)防感染,然后將髕骨復(fù)位,縫合關(guān)節(jié)囊,逐層縫合淺筋膜和皮膚。手術(shù)造模后大鼠籠內(nèi)自由活動。

1.3動物分組及干預(yù) 造模的20只大鼠標號后根據(jù)隨機數(shù)字表分為兩組。模型組術(shù)后籠內(nèi)自由活動不做任何干預(yù);被動運動組在造模術(shù)后第7天即開始進行被動運動,戴防抓咬手套,一手抓住大鼠身體,頭尾露出,另一手抓住右后肢足趾向后牽拉,至大鼠右后肢完全伸直,然后再將后肢推向身體,使髖、膝、踝關(guān)節(jié)完全屈曲,每次活動5 min,2次/d活動,注意活動過程輕柔,速度適中,連續(xù)4 w;在實驗方案結(jié)束后,大鼠通過脫頸方式處死。處死后取膝關(guān)節(jié)股骨髁部固定于4%中性甲醛中,取脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨置于-80 ℃冰箱保存,用于進行免疫組織化學評價和關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學分析及Western印跡及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等分析。

1.4關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學觀察 取出的膝關(guān)節(jié)標本立即固定于4%中性甲醛中,固定48 h之后,浸泡于10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液中4 w,脫鈣后進行石蠟包埋,切片,行蘇木素-伊紅(HE)染色、番紅-O-固綠染色及甲苯胺藍染色。鏡下觀察并進行Mankin評分〔13〕。

1.5免疫組織化學(IHC)分析 將膝關(guān)節(jié)軟骨切片先進行烤片,之后在二甲苯中脫蠟,通過梯度乙醇水化并在0.3% H2O2/甲醇中孵育30 min以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性,之后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗 20 min。然后將切片使用微波爐加熱暴露抗原活性,10%牛血清白蛋白封閉1 h,加白細胞介素(IL)-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13一抗4 ℃孵育過夜。次日室溫下二抗孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色后立即終止反應(yīng),用蘇木素復(fù)染,封片后光鏡下觀察染色情況,并用ImageJ軟件進行定量分析。

1.6RT-PCR分析 采用Trizol法提取軟骨組織總RNA,測RNA濃度,OD值260/280在1.8～2.0之間可用于下一步實驗。根據(jù)PrimeScript RT試劑盒的說明,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。設(shè)置好變性-退火-延伸反應(yīng)條件,經(jīng)40個循環(huán)。Gapdh作為內(nèi)參,mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平采用CT值法(2-△△Ct)計算。NF-κB抑制蛋白(IκB)上游：5′-AGAAATCTGGGAGCCCTGTG-3′,下游5′-ATGGCTGCCTAAATGCTCCA-3′;P65上游 5′-GAAGCACAGATACCACCAA-3′,下游5′-CAGCCTCATAGTAGCCATC-3′;IL-1β上游 5′-TGACCTCCACAGTTGACA-3′,下游 5′-CAGGCACTCCACATCTTG-3′;GAPDH上游 5′-GGTTTGCCGAGTAGACCTCA-3′;下游 5′-TGTAGCCGTATTCATTGTCA-3′。

1.7Western印跡法 提取軟骨組織總蛋白：將軟骨組織塊置于研缽內(nèi),加液氮,研磨成粉狀,加入蛋白裂解液放射免疫法緩沖液(RIPA)∶苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1。冰上裂解30 min。離心機設(shè)置12 000 r/min,4 ℃下離心30 min,將上清液分裝入新的EP管,得到組織總蛋白。經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度,計算上樣量。經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠電泳后,恒壓100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,之后用1×TBST洗膜3次,每次10 min,洗膜后加一抗4 ℃搖床過夜。次日回收一抗,1×TBST洗膜10 min×3次,之后加二抗室溫孵育2 h。洗膜后加發(fā)光液將條帶曝光。所得條帶定量分析用ImageJ軟件進行。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析,組間比較用Dunnett-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學 空白對照組關(guān)節(jié)表面光滑,軟骨層厚,軟骨細胞形態(tài)正常,排列整齊,軟骨基質(zhì)染色明顯,潮線完整;模型組關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則,血管翳形成,軟骨細胞數(shù)減少,空泡明顯,基質(zhì)染色較淺,潮線被血管破壞;被動運動組關(guān)節(jié)軟骨厚度增加,軟骨基質(zhì)染色較模型組加深,軟骨細胞彌漫性增加,潮線較完整。與空白對照組比較,模型組和被動運動組Mankin評分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,被動運動組Mankin評分明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組軟骨組織形態(tài)學

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分、軟骨中MMP-13、IL-1β陽性細胞面積百分比、IL-1β、NF-κB P65、IκB基因mRNA比較

2.2免疫組織化學結(jié)果 免疫陽性細胞均被染成棕褐色。觀察到各組標本中MMP-13和IL-1β的免疫陽性細胞,空白對照組免疫標記最少,模型組軟骨中棕褐色著色明顯,被動運動組介于兩者之間。經(jīng)ImageJ軟件計算陽性細胞面積百分比,與空白對照組相比,模型組和被動運動組MMP-13、IL-1β陽性細胞面積百分比明顯升高(P<0.05,P<0.01);被動運動組與模型組相比,陽性細胞面積百分比明顯減少(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組軟骨細胞中MMP-13、IL-1β表達(免疫組化染色,×400)

2.3各組IL-1β、NF-κB p65、IκB mRNA及蛋白表達 與空白對照組相比,模型組與被動運動組關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB p65、IL-1β的 mRNA及蛋白表達水平明顯上調(diào),IκB mRNA及蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)。被動運動組相比于模型組,NF-κB p65、 IL-1β mRNA蛋白表達量及均下降,IκB mRNA及蛋白表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β、NF-κB p65、IκB蛋白表達

3 討 論

KOA主要病理特征為軟骨退變、滑膜炎癥、骨贅形成及軟骨下骨改變等〔14～16〕。膝關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成,軟骨細胞分泌合成基質(zhì),自身則位于細胞外基質(zhì)陷窩內(nèi)。細胞外基質(zhì)的合成與降解失衡是導致軟骨退變的重要原因之一,軟骨基質(zhì)的降解和細胞炎性因子的產(chǎn)生對KOA的病理進展至關(guān)重要〔1,17,18〕。MMP-13是靶向軟骨降解的主要酶,與其他 MMP 相比,MMP-13在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨和Ⅱ型膠原蛋白降解中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用〔19～21〕。IL-1β可以獨立地誘導炎癥反應(yīng)和軟骨分解,也可以和其他介質(zhì)一同發(fā)揮致炎作用〔22〕。NF-κB涉及免疫、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥性疾病、細胞增殖和細胞死亡。據(jù)報道,在大部分哺乳動物中,NF-κB 由 Rel 家族的5個成員組成的同源二聚體和異源二聚體組成,包括 NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(p65)、RelB 和 c-Rel,在這些二聚體中,最常見的是由RelA(p65)和p50組成的異源二聚體,幾乎存在于所有哺乳動物細胞中〔7〕。NF-κB正常情況下存在與細胞質(zhì)中并與IκBα結(jié)合,處于無活性狀態(tài),但受到刺激后NF-κB被釋放并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核,隨后促進炎癥基因如MMP、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX)2和IL-1β的表達。所以NF-κB信號通路是KOA病情進展的重要的炎癥相關(guān)通路〔23～27〕。

KOA治療指南始終推薦基于運動的療法,臨床上被動運動適用于各種原因引起的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎,可拉伸肌肉及關(guān)節(jié)周圍韌帶,緩解肌肉痙攣、防止肌肉萎縮,恢復(fù)受損的關(guān)節(jié)周圍和關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)締組織,能在提高KOA患者關(guān)節(jié)活動度的同時,減輕疼痛并改善膝關(guān)節(jié)功能〔28～30〕。本實驗結(jié)果提示,被動運動可以抑制軟骨細胞炎癥及延緩軟骨降解退變,顯著抑制NF-κB信號通路的激活。

綜上所述,被動運動能夠抑制KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨炎癥、改善軟骨基質(zhì)降解,是一種簡單易行、成本低廉且行之有效的治療KOA的方法。本實驗只是從NF-κB單一信號通路研究了被動運動可能作用的靶點,選擇性地對關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β、MMP-13進行了研究,而KOA是由多條信號通路介導的多靶點影響的疾病,所以被動運動是否會影響其他信號通路和靶點,有待進一步研究。