曹西迎 謝春發(fā) 吳志誠 章祖雄 鐘煒祥 黃明登

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科,江西 贛州 341000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是人類常見的惡性腫瘤,占所有肺癌病例的80%～85%〔1〕。由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和不清楚的分子機(jī)制,目前對NSCLC的治療受到很大限制。解決此問題的方法是闡明NSCLC進(jìn)展的潛在機(jī)制。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的非凋亡性細(xì)胞死亡方式,涉及代謝功能異常,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝過程谷氨酰胺分解及產(chǎn)生鐵依賴性活性氧(ROS)、鐵載體蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白和線粒體超氧化物(MitoSOX)及膜電位減少并形成其他相關(guān)的調(diào)控因子,鐵和鐵衍生物在ROS酶的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用,表明鐵可能充當(dāng)細(xì)胞死亡信號的觸發(fā)或介體,特別是在鐵死亡中,含鐵酶對于鐵死亡必不可少〔2～4〕。據(jù)報道,miR-137在多種癌癥的發(fā)展中起抑癌作用,包括胰腺癌、大腸癌和NSCLC〔5〕。值得注意的是,miR-137通過靶向類固醇受體共激活子(SRC)3減慢人類NSCLC的細(xì)胞增殖,并通過下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白7抑制NSCLC細(xì)胞遷移〔6〕。谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族A1成員(SLC1A)5對于L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝至關(guān)重要,L-谷氨酰胺對癌細(xì)胞的生長至關(guān)重要,研究人員證實(shí)SLC1A5通過促進(jìn)谷氨酰胺代謝來促進(jìn)癌癥的發(fā)展〔7〕。SLC1A5參與了NSCLC進(jìn)程的調(diào)控,而SLC1A5的失活則通過減少L-谷氨酰胺的消耗而抑制了NSCLC細(xì)胞的活力〔8〕。此外,SLC1A5的上調(diào)促進(jìn)了甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞遷移和侵襲〔9〕,且SLC1A5可以被多種miRNA抑制。具體而言,SLC1A5被證明是miR-137的下游靶標(biāo),并參與黑色素瘤中腫瘤細(xì)胞死亡的調(diào)控〔10〕。髓系白血病1蛋白(MCL1)是主要的抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白,半衰期非常短,其在各種人類癌癥中的過表達(dá)表明,MCL1表達(dá)的增加有助于癌變,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的抑制〔11〕。有研究證明MCL1是miRNA作用的直接靶標(biāo),并在癌癥的發(fā)展中有促進(jìn)作用〔12〕。上述文獻(xiàn)顯示,miR-137可能通過依賴性的方式調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞中SLC1A5和MCL1的水平,參與細(xì)胞鐵死亡,但是其詳細(xì)機(jī)制未知。本研究探討miR-137通過靶向MCL1和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC1A5調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的鐵死亡機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,USA)獲得。在RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone,UT)中培養(yǎng)以上細(xì)胞,并在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件(5%CO2,37 ℃)下孵育。所有培養(yǎng)基補(bǔ)充10%胎牛血清(FBS)。

1.2siRNA、miRNA模擬物和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)細(xì)胞以進(jìn)行載體轉(zhuǎn)染,直至細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%。由Sangon Biotech(中國上海)設(shè)計和合成miR-NC,miR-137模擬物(5′-GGATCAAGATTGCAT-3′;5′-UUACAUGCGAUUACGUACAAUUGA-3′)和miR-137的小干擾RNA(siRNA),以敲除miR-137,用于構(gòu)建載體的siRNA序列如下：正義(5′-GGATCAAGATTGAAGCAT-3′)和反義(5′-UUACAUGCGAUUACG UACAAUUGA-3′)。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(10 nmol/L)遞送至A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h,準(zhǔn)備細(xì)胞用于分析。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,將細(xì)胞分為對照組(肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549規(guī)培條件下培養(yǎng),用于對照實(shí)驗(yàn))、miR-137轉(zhuǎn)染組(構(gòu)建miR-137轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞)、miR-137沉默組(構(gòu)建miR-137小干擾RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549)。

1.4實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的和未處理的對照細(xì)胞(1×104細(xì)胞/樣品)接種到96孔板中。為了研究MCL1和SLC1A5、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)4 mRNA表達(dá)水平的變化,根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程,使用TaqMan?基因表達(dá)細(xì)胞-CTTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。條件：37 ℃孵育60 min,95 ℃孵育5 min。RT-qPCR使用Applied Biosystems7500快速實(shí)時PCR系統(tǒng)進(jìn)行。使用TaqMan基因表達(dá)預(yù)混液和以下TaqMan基因表達(dá)測定法(探針和引物)擴(kuò)增靶mRNA。RT-qPCR熱循環(huán)條件如下：在50 ℃下初始變性2 min,在95 ℃下變性10 min,在95 ℃下進(jìn)行40次循環(huán)變性15 s,在60 ℃下進(jìn)行1 min變性。使用2-ΔΔCt方法計算靶mRNA表達(dá)水平。

1.5雙熒光素酶報告基因系統(tǒng) 使用在線StarBase軟件預(yù)測SLC1A5 mRNA的miR-137,MCL1和3′非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。分別對MCL1和SLC1A5 mRNA的一種特異性結(jié)合序列進(jìn)行突變。Sangon Biotech(中國上海)將野生型(Wt)和突變體(Mut)MCL1和SLC1A5 mRNA克隆到pmiRGLO表達(dá)載體中。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑,按照制造商的規(guī)程,將上述miR-NC(5 nmol/L)和miR-137模擬物(5 nmol/L)與上述載體(5 nmol/L)共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。24 h后,通過雙重?zé)晒馑孛笀蟮阑蛳到y(tǒng)確定細(xì)胞中的相對熒光素酶活性。

1.6鐵測定 使用鐵測定試劑盒測量每個細(xì)胞系中的Fe2+。首先,將2×106的細(xì)胞在4～10體積的鐵測定緩沖液中快速勻漿。將樣品在4 ℃于5 000 r/min離心10 min,以除去不溶物。為了測量二價鐵,向每個孔中加入5 μl鐵測定緩沖液。在一組孔中將5 μl的測定緩沖液添加到樣品中,在另一組孔中添加5 μl的鐵還原劑。使用水平搖床或通過移液器將樣品充分混合,并將反應(yīng)在室溫黑暗條件下孵育30 min。將100 μl鐵探針添加到每個裝有標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品的孔中。使用臥式搖床或移液器將樣品充分混合,將反應(yīng)在室溫黑暗條件下孵育60 min。最后在593 nm(A593)處測量吸光度。

1.7線粒體膜電位測量 為了使用線粒體膜電位試劑盒MAK-159測量線粒體膜電位,將5×104細(xì)胞接種在90 μl的黑色96孔板中,該板在無酚紅的培養(yǎng)基中具有清晰的堿基,并在第二天進(jìn)行處理加入二甲基亞砜(DMSO)或10 μmol/L的蛋白。孵育48 min后,將50 μl緩沖液A(1/100)中的JC-10染料添加到細(xì)胞中,并孵育60 min,添加50 μl緩沖液B。在微板讀取器上讀取板。監(jiān)測熒光強(qiáng)度水平(λex= 490/λem= 525 nm)和(λex=540/λem=590 nm)以進(jìn)行比率分析。紅色/綠色熒光強(qiáng)度的比率用于確定線粒體膜電位。

1.8MitoSOX的測量 使用用于活細(xì)胞成像的MitoSOXTMRed指示劑(專門設(shè)計用于MitoSOX的熒光探針)測量了細(xì)胞中MitoSOX的產(chǎn)生。將50 μg的MitoSOX指示劑溶解在13 μl的DMSO中,形成5 μmol/L的MitoSOX試劑儲備液。在Hank的鹽緩沖液/鈣(Ca)/鎂(Mg)緩沖液中稀釋5 μmol/L MitoSOX試劑原液,制成5 μm MitoSOX試劑工作液。應(yīng)用2.0 μml的5 μmol/L MitoSOX試劑工作溶液,以覆蓋黏附在蓋玻片上的細(xì)胞。將細(xì)胞在黑暗條件下于37 ℃孵育30 min。將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗3次。細(xì)胞熒光在倒置熒光顯微鏡下以510/580 nm的激發(fā)/發(fā)射值進(jìn)行檢查。用ImageJ軟件定量熒光強(qiáng)度。結(jié)果表示為相對于對照標(biāo)準(zhǔn)化的相對熒光強(qiáng)度水平。

1.9脂質(zhì)過氧化評估 根據(jù)熒光定量酶標(biāo)儀,使用熒光讀板儀和6-羧基-2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯染料檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。根據(jù)制造商的規(guī)程,使用丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所,南京)來檢測脂質(zhì)過氧化水平。使用氧化型谷胱甘肽(GSSG)/還原型谷胱甘肽(GSH)定量試劑盒確定SFN(20 μmol/L)處理96 h和未處理的細(xì)胞(5×106細(xì)胞/樣品)中的總GSH水平。使用Multiskan GO微板分光光度計在405 nm處測量每個樣品的吸光度。使用GraphPad Prism軟件從校準(zhǔn)曲線獲得GSH濃度?？偣策M(jìn)行3個獨(dú)立的重復(fù)。

1.10流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的密度在37 ℃下接種到24孔板中96 h。根據(jù)制造商的說明,使用用于哺乳動物細(xì)胞分析的LIVE/DEADTM活力/細(xì)胞毒性試劑盒測量細(xì)胞毒性。鈣黃綠素-AM保留在活細(xì)胞中,產(chǎn)生綠色熒光,而乙二胺均二聚體(EthD)-1進(jìn)入具有受損膜的死細(xì)胞并與核酸結(jié)合,產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)初步實(shí)驗(yàn),使用濃度為50 μmol/L鈣黃綠素-AM和4 μmol/L EthD-1溶液(數(shù)據(jù)未顯示)。使用流式細(xì)胞儀和Kaluza軟件進(jìn)行分析。

1.11Transwell測定NSCLC細(xì)胞侵襲能力 為了進(jìn)行遷移測定,將5×105細(xì)胞接種到Transwell培養(yǎng)板(Corning,中國上海)的上腔室中。將添加了15%FBS的培養(yǎng)基放入下腔室。為了進(jìn)行侵襲測定,用基質(zhì)膠(目錄號356234,康寧)溶液包被Transwell室。將約5×105細(xì)胞(200 μl)接種到板的上腔室中,并將含15%FBS(600 μl)的培養(yǎng)基放入下腔室中。分別孵育24或48 h以進(jìn)行遷移或侵襲試驗(yàn)后,將滲透到膜下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定60 min,用結(jié)晶紫染色80 min并計數(shù)。

1.12TUNEL測定相關(guān)載體轉(zhuǎn)染的NSCLC凋亡細(xì)胞 用試劑盒提供的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)混合物對細(xì)胞進(jìn)行染色。核DNA用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。用光學(xué)顯微鏡觀察TUNEL陽性細(xì)胞以評估細(xì)胞凋亡。通過使用ImageJ軟件定量NSCLC細(xì)胞的凋亡率。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行配對或不配對的學(xué)生t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及單向或雙向方差分析,采用Tukey的事后多重比較法。

2 結(jié) 果

2.1miR-137調(diào)控MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示,miR-137沉默組較miR-137轉(zhuǎn)染組和對照組MCL1、GPX4和SLC1A5 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),miR-137轉(zhuǎn)染組較對照組上述指標(biāo)表達(dá)顯著降低(P<0.05),表明MCL1、SLC1A5和GPX4表達(dá)受到miR-137調(diào)控。見圖1、表1。

表1 各組MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表達(dá)

圖1 各組MCL1、SLC1A5和GPX4 mRNA表達(dá)

2.2雙重?zé)晒馑孛笢y定 雙重?zé)晒馑孛笀蟾娼Y(jié)果顯示,與對照組相比,miR-137轉(zhuǎn)染組顯著降低了Wt-SLC1A5和Wt-MCL1載體共轉(zhuǎn)染的NSCLC細(xì)胞中的熒光素酶活性(P<0.05),而Mut-SLC1A5和Mut-MCL1模擬共轉(zhuǎn)染熒光素酶活性酶未發(fā)生顯著變化(P>0.05),說明miR-137靶向調(diào)控MCL1和SLC1A。見表2。

表2 熒光素酶測定miR-137與MCL1和SLC1A的靶向作用

2.3miR-137過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡 miR-137沉默組較miR-137轉(zhuǎn)染組和對照組Fe2+濃度、MitoSOX濃度顯著降低,線粒體相對膜電位顯著升高(P<0.05);miR-137轉(zhuǎn)染組較對照組Fe2+濃度、MitoSOX濃度顯著升高,線粒體相對膜電位顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞鐵吸收、線粒體功能評估及脂質(zhì)氧化反應(yīng)水平檢測

2.4miR-137對細(xì)胞鐵下垂的調(diào)控 miR-137沉默組較miR-137轉(zhuǎn)染組和對照組ROS和MDA濃度顯著降低,GSH濃度顯著升高(P<0.05);miR-137轉(zhuǎn)染組較對照組ROS和MDA濃度顯著升高,GSH濃度顯著降低(P<0.05)。說明miR-137參與細(xì)胞的鐵誘導(dǎo)死亡程序。見表3。

2.5細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測 Transwell結(jié)果顯示,miR-137沉默組較miR-137轉(zhuǎn)染組和對照組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量顯著增多(P<0.05),miR-137轉(zhuǎn)染組較對照組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量顯著減少(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡率、遷移及侵襲數(shù)量比較

圖2 各組細(xì)胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.6細(xì)胞凋亡分析 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,24、48和72 h檢測發(fā)現(xiàn)miR-137轉(zhuǎn)染組較miR-137沉默組和對照組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),72 h時miR-137沉默組較對照組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 TUNEL分析各組細(xì)胞凋亡水平(DAPI染色,×200)

3 討 論

近年來,科學(xué)家們意識到除凋亡外的細(xì)胞死亡可用于消除癌細(xì)胞。進(jìn)一步研究確定了其中的一些死亡,例如燒傷、程序性壞死和鐵死亡?？茖W(xué)家們揭示了鐵減少癥的參與消除了對抗癌藥物具有抗性的癌細(xì)胞,盡管其具體機(jī)制尚不清楚。其他研究發(fā)現(xiàn),某些傳統(tǒng)藥物可能以自噬依賴性方式觸發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞死亡,這表明鐵死亡可以作為一種有效的方法治療癌癥〔13〕。由于鐵死亡的功能主要取決于ROS,而ROS受多種因素調(diào)節(jié),例如鐵水平、還原型GSH水平和脂質(zhì)過氧化水平〔14〕。鐵死亡是一種最近定義的調(diào)節(jié)型細(xì)胞死亡類型,在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方面不同于其他類型的細(xì)胞死亡。在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的各種差異中,癌細(xì)胞的一個顯著特征是即使在存在氧氣的情況下也切換到厭氧代謝,這被稱為Warburg效應(yīng)〔15〕。在各種癌癥中的觀察表明,隨著三羧酸循環(huán)(新陳代謝中的關(guān)鍵氧化循環(huán))的顯著變化,細(xì)胞的新陳代謝也發(fā)生了變化。鐵是一種至關(guān)重要的金屬元素,對于細(xì)胞復(fù)制、新陳代謝和生長是必不可少的。其中脂質(zhì)過氧化作用是由游離細(xì)胞內(nèi)鐵引發(fā)的以碳和氧為中心的自由基介導(dǎo)的〔16〕。亞鐵在與過氧化氫的反應(yīng)中提供電子,產(chǎn)生羥基自由基,一種ROS。這種反應(yīng)不僅會損害脂質(zhì)和蛋白質(zhì),還會對DNA造成氧化損害。線粒體是重要的細(xì)胞器,參與能量代謝、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡途徑調(diào)控,包括鐵死亡。此外,線粒體的凝縮、線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的減少和線粒體尺寸的減少在形態(tài)學(xué)上被描繪成鐵死亡。導(dǎo)致肥大細(xì)胞死亡的兩個主要因素是游離鐵增加和脂質(zhì)過氧化物積累〔17〕。雌鐵蛋白誘導(dǎo)的鐵蓄積可通過鐵螯合、抗氧化劑或細(xì)胞鐵攝取的遺傳抑制來避免,其可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和隨后的死亡。本研究結(jié)果說明,線粒體參與了miR-137/SLC1A5/MCL1軸對細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控。

miR-137可以作為抑制NSCLC發(fā)生的腫瘤抑制因子〔18〕,這一點(diǎn)在本研究中也得到了證實(shí)。在細(xì)胞系A(chǔ)549中觀察到低表達(dá)的miR-137,而miR-137過表達(dá)抑制了NSCLC細(xì)胞的活力和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而miR-137的下調(diào)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的活力和遷移,這暗示miR-137的上調(diào)會阻礙NSCLC在體外的發(fā)育〔18〕。一致地,這項(xiàng)研究證實(shí)了miR-137負(fù)調(diào)控MCL1和SLC1A5,本研究證明了miR-137通過下調(diào)MCL1和SLC1A5來調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞功能。從機(jī)制上講,上調(diào)miR-137對促進(jìn)NSCLC細(xì)胞鐵死亡和侵襲的抑制作用均可以通過敲低miR-137而逆轉(zhuǎn),表明miR-137通過下調(diào)MCL1和SLC1A5抑制了NSCLC中的惡性表型。鐵死亡是由細(xì)胞GSH依賴的抗氧化劑防御系統(tǒng)失活觸發(fā)的,導(dǎo)致鐵依賴的有毒脂質(zhì)ROS的積累。鐵死亡是鐵依賴性的非凋亡調(diào)控形式的細(xì)胞死亡,可被鐵螯合劑DFO抑制。但是,肥大癥在SCLC細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明,MCL1和SLC1A5參與了SCLC細(xì)胞的鐵死亡。

SLC1A5和MCL1參與了癌癥進(jìn)展的調(diào)控,其調(diào)控癌細(xì)胞的生長和遷移率〔19〕。值得注意的是,先前的數(shù)據(jù)表明SLC1A5可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,這在本研究中得到了驗(yàn)證〔20〕。具體而言,通過分析臨床標(biāo)本中SLC1A5的表達(dá)模式,本文發(fā)現(xiàn)SLC1A5參與了細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制。作為人類癌癥中最常見的擴(kuò)增基因之一,MCL1過表達(dá)已被確定與高腫瘤分級和患者生存率降低相關(guān)〔21〕。研究表明,MCL1可能參與腫瘤細(xì)胞鐵死亡的凋亡機(jī)制,在抗腫瘤中起關(guān)鍵作用,這對于發(fā)展抗癌性很重要〔22〕。本研究證明了SLC1A5和MCL1是miR-137的下游靶標(biāo),而miR-137沉默則上調(diào)SLC1A5以增強(qiáng)腫瘤谷氨酰胺代謝。正如預(yù)期結(jié)果,證明miR-137可以作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑,通過靶向其3′非翻譯區(qū)(UTR)使SLC1A5和MCL-1沉默,并通過miR-137海綿化。作為鐵死亡的重要成員,GPX4可以消除ROS。在許多研究中,科學(xué)家將調(diào)節(jié)GSH水平的藥物定義為Ⅰ類促鐵死亡誘導(dǎo)劑,將影響GPX4活性的藥物定義為Ⅱ類育肥性誘導(dǎo)劑。本研究發(fā)現(xiàn),miR-137可以影響肺癌細(xì)胞中GPX4的表達(dá)水平,并揭示了GPX4在鐵死亡中的作用。在先前的研究中,發(fā)現(xiàn)GPX4促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。本研究發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞中降低GPX4可誘導(dǎo)的鐵死亡并不新鮮,因?yàn)橐汛_認(rèn)GPX4是鐵死亡的抑制劑。

綜上所述,上調(diào)miR-137可以沉默SLC1A5和MCL1,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡引起的細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出抗癌作用。