圖布新 通啦嘎 包海金 李桂花 色·色日道爾吉 瑟·道爾吉巴圖 浩仁他本

骨質(zhì)疏松是一種慢性代謝性疾病,以低骨量密度和微結(jié)構(gòu)退化為特征的骨骼疾病,易導(dǎo)致患者骨折〔1〕,嚴(yán)重影響患者的生命健康。研究證明,成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收之間的動(dòng)態(tài)失衡是形成骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制,成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要作用〔2〕。微小RNA(miRNA)是一種小的單鏈非編碼RNA,是一類(lèi)重要的細(xì)胞功能基因調(diào)節(jié)因子。它們通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來(lái)抑制蛋白質(zhì)表達(dá)〔3〕,多項(xiàng)研究證實(shí),miRNA可能通過(guò)靶向其下游基因參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖作用〔4～6〕,miR-204在骨質(zhì)疏松中起到重要的作用〔7,8〕。盡管如此,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性的特異性miRNAs尚未得到很好的表征,這些miRNAs在成骨細(xì)胞中靶基因表達(dá)的機(jī)制仍有待闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn),蒙藥壯西-4治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者具有明顯的療效〔9〕,但其確切的抗骨質(zhì)疏松機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)觀(guān)察蒙藥壯西-4對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清miR-204表達(dá)的影響,探討蒙藥壯西-4對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠60只,磁性8周齡,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔SCXK(京)2018-0021〕,體質(zhì)量(250±10)g,飼養(yǎng)于濕度(50±5)%、溫度(24.5±0.5)℃的環(huán)境,保持良好的通風(fēng)條件。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)(20210011),實(shí)驗(yàn)符合3R原則。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：蒙藥壯西-4味散(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室,批號(hào)M15060996);CalciD-Denk片(德國(guó),批號(hào)190003887);維A酸(陜西森弗生物技術(shù)有限公司,批號(hào)SCI120308-03);戊酸雌二醇片(E2V;批號(hào)073A4)。放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液(北京天根生化科技有限公司);己烯雌酚(北京四環(huán)制藥二廠(chǎng),批號(hào)：H08074256)。骨橋蛋白(OPN)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體及二抗(上海船夫生物科技有限公司)。miR-204模擬物(mimics)、miR-204抑制物(inhibitor)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。Model550酶標(biāo)儀(日本BIO-MED公司)。

圖1 各組RANKL和OPG蛋白表達(dá)

1.2骨質(zhì)疏松模型建立 將60只SD大鼠適宜性喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和蒙藥壯西-4低、中、高劑量組,每組10只。參考張建花等〔10〕骨質(zhì)疏松模型建立方法,模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和蒙藥壯西-4低、中、高劑量組給予70 mg/kg維A酸溶液灌胃,空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水溶液灌胃,1次/d,共14 d。第15天后,低、中、高劑量組分別給予不同劑量(50、100、200 mg/kg)的蒙藥壯西-4溶液灌胃,陽(yáng)性對(duì)照組給予0.2 mg/kg戊酸雌二醇溶液灌胃,空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水溶液灌胃,1次/d,連續(xù)42 d。

1.3大鼠骨密度(BMD)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)進(jìn)行麻醉腹腔注射,利用骨密度儀測(cè)定大鼠第4腰椎及右股骨的BMD值。

1.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)血清miR-204表達(dá)量 測(cè)定BMD后,手術(shù)剪剪開(kāi)腹腔,采集腹主動(dòng)脈血液5 ml,4 ℃條件下,3 000 r/min離心10 min,靜置分離出血清,置于-80 ℃醫(yī)用冰箱中保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取和收集血清總RNA,對(duì)RNA濃度、純度進(jìn)行檢測(cè)后,根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)混合物,每個(gè)反應(yīng)體系為20 μl,使用PCR儀檢測(cè)miR-204相對(duì)表達(dá)量。PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng),95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s制備溶解曲線(xiàn)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算相應(yīng)miR-204相對(duì)表達(dá)量。引物序列(5′-3′)為：miR-204上游：GCGCGCTACAGTATAGATGATG,下游：GCTGTCAACGATACGCTACG;U6上游：CTCGCTTCGGC AGCACA,下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清OPG和RANKL水平 測(cè)定大鼠BMD后,手術(shù)剪剪開(kāi)腹腔,采集腹主動(dòng)脈血液5 ml,4 ℃條件下,3 000 r/min離心10 min,靜置分離出血清,置于-80 ℃醫(yī)用冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎萌詣?dòng)酶免分析儀,通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清RANKL和OPG表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1復(fù)蘇后,加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基,置于37 ℃室溫和含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)分化,傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml接種于96孔板中。根據(jù)藥物干預(yù)的情況,分為對(duì)照組、抑制組、促進(jìn)組、藥物組,其中在96孔板中抑制組加入miR-204抑制劑,促進(jìn)組加入miR-204模擬物,藥物組加入蒙藥壯西-4,對(duì)照組不做任何干預(yù)處理。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,觀(guān)察相關(guān)指標(biāo)。

1.7實(shí)驗(yàn)細(xì)胞miR-204表達(dá)量 收集96孔板細(xì)胞液,參照1.5步驟,采用RT-PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞miR-204表達(dá)量。

1.8Western印跡檢測(cè)細(xì)胞RANKL和OPG蛋白表達(dá)量 提取血清總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白定量。在120 V電壓條件下持續(xù)電泳至樣品到達(dá)凝膠底部,半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,洗膜后剪下相應(yīng)條帶,分別加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育。次日取出PVDF膜,用洗膜緩沖液TBST洗脫3次,再加入二抗反應(yīng)液,置于搖床上搖動(dòng),洗脫3次。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)溶液顯色,自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像,以目的蛋白與GAPDH的吸光度比值表示相對(duì)蛋白含量。

1.9噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集行干預(yù)措施后的MC3T3-E1細(xì)胞,加入100 μl 5 mg/ml MTT溶液,37 ℃條件下孵育4 h,棄置上清液,再加入200 μl二甲基亞砜溶液,37 ℃條件下繼續(xù)孵育10 min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(OD490 nm值),計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm×100%。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1蒙藥壯西-4對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠BMD的影響 與空白對(duì)照組比較,建模各組第4腰椎和右股骨BMD值明顯降低(均P<0.05)。與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組第4腰椎和右股骨BMD值明顯升高(均P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,低、高劑量組第4腰椎和右股骨BMD值明顯降低(均P<0.05)。與低劑量組比較,中、高劑量組第4腰椎和右股骨BMD值明顯升高,且中劑量組明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組BMD值、血清miR-204相對(duì)表達(dá)及RANKL、OPG含量比較

2.2蒙藥壯西-4對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清miR-204表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,建模各組血清miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)。與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組血清miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯升高(均P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照比較,低、高劑量組血清miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)。與低劑量組比較,中、高劑量組血清miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯升高(均P<0.05),且中劑量組顯著高于高劑量組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3蒙藥壯西-4對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清RANKL、OPG含量的影響 與空白對(duì)照組比較,建模各組血清OPG含量明顯降低,RANKL含量明顯升高(均P<0.05)。與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組血清OPG含量明顯升高,RANKL含量明顯降低(均P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,低、高劑量組血清OPG含量明顯降低,RANKL含量明顯升高(均P<0.05)。與低劑量組比較,中、高劑量組血清OPG含量明顯升高,RANKL含量明顯降低(均P<0.05)。與中劑量組比較,高劑量組血清OPG含量明顯降低,血清RANKL含量顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4蒙藥壯西-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞miR-204表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,促進(jìn)組和藥物組miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯升高,抑制組miR-204相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與抑制組比較,藥物組miR-204相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 MC3T3-E1細(xì)胞miR-204和RANKL、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞存活率比較

2.5蒙藥壯西-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞RANKL、OPG蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,促進(jìn)組和藥物組MC3T3-E1細(xì)胞RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低,OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05);抑制組MC3T3-E1細(xì)胞RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高,OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與藥物組比較,促進(jìn)組細(xì)胞RANKL蛋白和OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05);抑制組細(xì)胞RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高,OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

2.6蒙藥壯西-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較,促進(jìn)組和藥物組細(xì)胞存活率明顯升高(均P<0.05),抑制組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。與藥物組比較,抑制組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

骨質(zhì)疏松是一種全身骨代謝性疾病,其主要特征是骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)改變,伴隨骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加等,嚴(yán)重影響中老年人生命健康。目前抗骨質(zhì)疏松藥物主要是針對(duì)預(yù)防、抗骨吸收和促骨形成等方面進(jìn)行治療,進(jìn)而延緩骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折的發(fā)生,但是其長(zhǎng)期治療效果因不良反應(yīng)而存在爭(zhēng)議。因此,尋找治療骨質(zhì)疏松有效,且不良反應(yīng)少的藥物顯得格外重要。蒙醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松有悠久的歷史和成熟的經(jīng)驗(yàn),蒙藥壯西-4在臨床上治療骨質(zhì)疏松的療效較好。

目前,可以通過(guò)多種方法建立骨質(zhì)疏松模型,使用維A酸灌胃誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型是最為常見(jiàn)的方法〔11,12〕,其基本原理是維A酸可以激活破骨細(xì)胞活性,增加破骨細(xì)胞,加強(qiáng)骨吸收機(jī)制,骨吸收與骨形成平衡系統(tǒng)被破壞,而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松〔13〕。另一方面,甲酸灌胃誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松操作簡(jiǎn)便,造模時(shí)間短,節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本,提高實(shí)驗(yàn)成功率。戊酸雌二醇片為雌激素類(lèi)藥,是人體天然雌激素17B-雌二醇的前體,研究證實(shí),其可用于預(yù)防原發(fā)性或繼發(fā)性雌激素缺乏所造成的骨質(zhì)丟失而引起的骨質(zhì)疏松〔14〕。而大鼠口服維A酸可損傷性腺,體內(nèi)雌激素水平受到影響,從而導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔10〕,可以通過(guò)補(bǔ)充雌激素進(jìn)行治療。因此,本研究選取戊酸雌二醇片作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。BMD是診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn),本研究結(jié)果提示,建模成功。此外,蒙藥壯西-4和戊酸雌二醇能夠增加維A酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型大鼠BMD,對(duì)于治療骨質(zhì)疏松具有潛在的價(jià)值。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在骨重塑的調(diào)節(jié)中起主要作用,RANKL和OPG調(diào)節(jié)骨重塑和破骨細(xì)胞生成〔15〕。其參與調(diào)節(jié)正常的骨重建過(guò)程,OPG主要作用為成骨,引起骨形成,且可通過(guò)阻斷RANK和 RANKI的結(jié)合抑制破骨細(xì)胞分化形成,從而抑制骨吸收。RANKL主要作用為破骨,通過(guò)與前破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合刺激破骨細(xì)胞分化,引起骨吸收。有研究證實(shí),成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的OPG是RANKL的誘餌受體,可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡,抑制骨吸收〔16,17〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),缺乏OPG基因的小鼠骨吸收能力增強(qiáng),容易引起骨質(zhì)疏松。過(guò)表達(dá)RANKL基因的小鼠BMD嚴(yán)重減低〔18〕。RANKL和OPG表達(dá)量可用于評(píng)估成骨細(xì)胞的活性,OPG表達(dá)升高或RANKL表達(dá)降低表示成骨細(xì)胞活躍。本研究結(jié)果表明,蒙藥壯西-4可影響成骨細(xì)胞的增殖,對(duì)治療骨質(zhì)疏松具有積極作用,對(duì)miR-204表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,提示蒙藥壯西-4具有調(diào)節(jié)miR-204表達(dá)而影響成骨細(xì)胞活性的作用。

綜上,蒙藥壯西-4能增加骨質(zhì)疏松大鼠BMD,其可能機(jī)制為通過(guò)上調(diào)miR-204表達(dá)促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖。