饒習(xí)敏 顧延會 劉曉麗 張?zhí)m英 歐陽瑤

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科,貴州 遵義 563000)

急性肺損傷(ALI)是指肺部疾病進(jìn)展至功能衰退的病理環(huán)節(jié)〔1〕。在病理性發(fā)展中,內(nèi)毒素能夠促進(jìn)機體生成大量炎性因子,炎性因子與效應(yīng)細(xì)胞相互作用會導(dǎo)致彌漫性炎性肺泡浸潤及肺血管壁增厚〔2〕。若未及時得到有效治療,極易引發(fā)肺組織纖維化、肺衰竭危及生命,但臨床尚未明確ALI的具體發(fā)病機制〔3〕。鹽酸氨溴索是常見祛痰藥,在化痰、改善呼吸方面具有良好的臨床效果。據(jù)報道〔4〕,鹽酸氨溴索能夠抑制肺組織炎性應(yīng)激反應(yīng),平衡細(xì)胞凋亡和增殖,從而減輕肺組織損傷。肺部是革蘭陰性細(xì)菌引發(fā)的膿毒癥極易損傷的器官,表現(xiàn)為ALI,是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。臨床認(rèn)為ALI病理反應(yīng)過程中革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖(LPS)發(fā)揮出關(guān)鍵作用〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)〔6〕,LPS誘導(dǎo)ALI后,肺部因炎癥反應(yīng)會釋放白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13等多種細(xì)胞因子,影響肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡等生理狀態(tài),而肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡是誘發(fā)肺血管重塑的基礎(chǔ)。目前鹽酸氨溴索與ALI血管重塑的相關(guān)性未見文獻(xiàn)報道。本研究探討鹽酸氨溴索對LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺血管重塑的改善作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 實驗動物：選取醫(yī)院動物實驗中心提供的80只8～10周齡SPF級成年SD大鼠,動物合格證號：SYXK(京)2019-0096,平均體質(zhì)量(240±200)g,大鼠均于SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好,溫度(25±2)℃,濕度40%～60%,大鼠飲食不設(shè)限制,熟悉環(huán)境1 w后,第2周開始展開實驗流程。大鼠相關(guān)操作流程均獲得醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2019-032)。主要試劑：鹽酸氨溴索口服溶液購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司,地塞米松(DXMS)購自湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,LPS、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)和Bcl-2抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) 抗體均購自美國Santa公司,Western印跡試劑盒(美國R&D公司),免疫組化試劑盒、彈力纖維(EVG)染色試劑盒購自江蘇綠葉生物科技有限公司,蛋白濃度測定試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自英國Abcam。主要儀器：冰箱購自海爾公司,臺式低溫高速離心機購自美國Thermo公司,化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自北京君意東方電泳公司,LeicaRM2135組織切片機購自德國Leica公司。

1.2構(gòu)建ALI大鼠模型及分組 大鼠常規(guī)喂養(yǎng)7 d后,采用隨機數(shù)字法分為正常組、模型組、鹽酸氨溴索處理ALI組(實驗組)、陽性對照藥地塞米松(DXMS)處理組(陽性組)各20只。除正常組外,其余各組尾部靜脈注射5 mg/kg的LPS構(gòu)建ALI模型,注射劑量0.5 ml,正常組給予等體積的生理鹽水;大鼠模型完成后,每日分別在實驗組和陽性組大鼠皮下注射1 ml、規(guī)格為20 mg/kg的鹽酸氨溴索和DXMS,連續(xù)給藥28 d,正常組、模型組分別注射與實驗組和陽性組等量的生理鹽水。完成注射后,大鼠自由飲食,不加限制。

1.3檢測各組呼吸功能 給藥結(jié)束后次日分別在特定描記箱中的大鼠昏迷和清醒狀態(tài)時采用動物肺功能測定儀測定潮氣量、呼吸頻率及每分鐘通氣量,期間需運行IOX軟件。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組肺組織病理學(xué)改變 全部大鼠測定肺功能結(jié)束后,通過頸椎脫臼處死大鼠,解剖取大鼠肺組織,在-80 ℃冰箱中放置90%肺組織待檢測。另外用10%多聚甲醛液固定剩余10%肺組織24 h,石蠟切片,攤、烤完成后展開HE染色,封片后采用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.5EVG染色檢測各組肺組織肺血管重塑 取出各組部分肺臟組織,固定,石蠟包埋,脫蠟,滅菌常規(guī)10 min清洗,EVG染色肺部組織15 min,熒光顯微鏡倒置并輔助Image Pro Plus8.0軟件觀察肺組織肺血管重塑情況。血管中膜厚度占比：每組選取10～15根肺小動脈,直徑均為25～100 μm,分別測定血管內(nèi)徑和外徑厚度,計算相對中膜厚度(%)=〔(血管外徑-血管內(nèi)徑)/血管外徑〕×100%〔7〕。

1.6TUNEL染色檢測各組肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡 取部分肺組織,固定完成后,冰凍切片,二甲苯重復(fù)清洗2次,梯度酒精反復(fù)沖洗5 min,脫水后利用H2O2-甲醇進(jìn)行10 min浸泡,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗15 min,后在預(yù)冷酒精溶液中緩沖液預(yù)處理2 min,PBS沖洗15 min,加入TUNEL反應(yīng)溶液,避光加封口膜1 h,PBS沖洗,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況,并拍照。正常平滑肌細(xì)胞遇TUNEL反應(yīng)溶液細(xì)胞核呈藍(lán)色,反之呈棕黃色,用400倍鏡觀察并計算肺動脈凋亡平滑肌細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.7免疫組化檢測肺組織中α-SMA、VEGF蛋白表達(dá)及血管肌化程度 PBS沖洗脫蠟及水化完成后的肺組織切片,利用PBS高壓修復(fù)脫蠟、水化完成后的切片組織,然后用3% H2O2室溫下浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,封閉后分別加稀釋好的一抗4 ℃過夜孵育,第2天恢復(fù)室溫后PBS沖洗,加入稀釋完成的二抗,室溫下30 min孵育,PBS沖洗。加入DAB繼續(xù)孵育5 min,加入去離子水中斷孵育,加入蘇木素染色,無菌水充分清洗后,梯度酒精反復(fù)沖洗2 h,脫水完成后,去除組織表面液體,透明、封片,利用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)并攝片。依據(jù)參考文獻(xiàn)〔8〕方法評估陽性細(xì)胞程度,利用10個高倍鏡視野(×200)光學(xué)顯微鏡下觀察切片中陽性細(xì)胞數(shù),每個視野取200個細(xì)胞觀察陽性占比,陽性細(xì)胞染色程度評分：未染色為0分,淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。陽性細(xì)胞計分：無陽性細(xì)胞為0分,1%～10%陽性細(xì)胞為1分、11%～50%陽性細(xì)胞為2分,51%～75%陽性細(xì)胞為3分,>75%陽性細(xì)胞為4分。免疫組化染色結(jié)果為陽性細(xì)胞染色程度評分與陽性細(xì)胞計分的乘積。

血管肌化程度：觀察α-SMA免疫組化切片組織,用10個高倍視野觀察切片血管肌化程度,選擇15～50 μm直徑的肺小動脈,肌化判定標(biāo)準(zhǔn)：切片血管壁α-SMA 染色呈陽性,α-SMA染色陽性占比>75%定義為全部肌化,血管全部肌化占比=全部肌化血管數(shù)/觀察血管總數(shù)×100%〔9〕。

1.8線粒體膜電位變化情況檢測 取肺組織加入組織裂解液后,根據(jù)線粒體/胞質(zhì)制備試劑盒說明書步驟,提取線粒體。根據(jù)試劑盒步驟說明加入500 μl線粒體膜電位試劑盒(JC-1)染色工作液,37 ℃下孵育20 min后再用JC-1染色工作液清洗2次,用共聚焦熒光顯微鏡觀察波長對細(xì)胞顯色水平的影響,膜電位變化可通過ImageJ軟件重疊紅、綠熒光,以紅、綠色熒光光密度比值得出。

1.9Western印跡檢測各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平 取出各組肺組織,加入裂解液,離心取上清,電泳后,加入一抗(1∶1 500),二抗(1∶1 500)稀釋后,顯色30 min,完成曝光、顯影、定影后,參照GAPDH分析肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶積分光密度(IOD)值,以靶蛋白與GAPDH 的IOD值比值表示靶蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組呼吸功能比較 模型組呼吸頻率明顯高于正常組,通氣量和潮氣量明顯低于正常組(P<0.05);實驗組、陽性組呼吸頻率明顯低于模型組,通氣量和潮氣量明顯高于模型組(P<0.05),實驗組和陽性組以上指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組呼吸功能比較

2.2各組肺組織病理學(xué)觀察 正常組肺組織完整,肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰且完整,肺泡健康排列,無水腫、炎性因子分泌、滲出分泌物等現(xiàn)象。模型組氣道及毛細(xì)血管周圍存在大量炎性因子浸潤,肺泡壁排隊不規(guī)則,管腔狹窄,血管壁不合理增厚。實驗組及陽性組陽性因子浸潤較模型組好轉(zhuǎn),肺組織病理癥狀減輕。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)(HE染色,×200)

2.3EVG染色觀察各組肺組織血管重塑 正常組肺組織血管結(jié)構(gòu)正常,無異常管壁增厚。模型組肺小動脈中膜厚度增加比例〔(54.92±5.73)%〕高于對照組〔(10.02±1.28)%〕,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=34.201,P<0.001)。而實驗組〔(23.45±4.85)%〕、陽性組肺小動脈中膜厚度增加比例〔(25.82±5.02)%〕小于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.748、17.083,均P<0.001)。實驗組和陽性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.518,P=0.137)。見圖2。

圖2 各組肺組織血管重塑(EVG染色,×400)

2.4免疫組化檢測各組肺組織中α-SMA和VEGF蛋白表達(dá) 模型組肺組織α-SMA和VEGF蛋白表達(dá)及血管肌化程度明顯高于正常組(P<0.05),實驗組、陽性組肺組織α-SMA和VEGF表達(dá)及血管肌化程度明顯低于模型組(P<0.05);實驗組和陽性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 各組肺組織中α-SMA、VEGF陽性表達(dá)評分和血管肌化程度比較

2.5TUNEL染色檢測各組肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡 模型組肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡率〔(48.32±6.79)%〕明顯高于正常組〔(9.85±2.42)%;t=23.867,P<0.001〕,實驗組〔(31.06±7.48)%〕、陽性組肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡率〔(26.54±8.12)%〕明顯低于模型組(t=7.641、9.202,均P<0.001)。實驗組和陽性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.831,P=0.075)。見圖4。

圖4 各組肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6Western印跡檢測各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 模型組肺組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯高于正常組,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05);實驗組和陽性組肺組織中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯低于模型組,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05);實驗組和陽性組差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見圖5、表3。

圖5 各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組肺組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較

2.7線粒體膜電位變化 正常組中細(xì)胞線粒體膜電位〔紅色熒光與綠色熒光比值(28.63±7.45)%〕處于低水平,模型組細(xì)胞線粒體膜電位〔(80.05±12.37)%〕較正常組明顯增加(t=15.925,P<0.001),實驗組〔(55.24±10.83)%〕、陽性組線粒體膜電位〔(56.79±15.28)%〕明顯低于模型組(t=6.749、5.291,均P<0.001),實驗組和陽性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.370,P=0.703)。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較(JC-1染色,×400)

3 討 論

ALI是臨床常見疾病,其致病因素較多,包括感染、休克、肺挫傷等外界因素引發(fā)肺部毛細(xì)血管功能損傷,導(dǎo)致大鼠肺小動脈中膜厚度增加、呼吸受限〔10〕。ALI病情復(fù)雜,且進(jìn)展迅速,臨床上救治的關(guān)鍵是及時緩解癥狀,若病情不加以控制極易進(jìn)展為呼吸衰竭,甚至隨時危及患者生命安全,但目前針對ALI尚缺乏有效的救治手段,因此明確ALI的發(fā)病機制是臨床危重病學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題之一。本研究結(jié)果說明模型構(gòu)建成功,可用于進(jìn)一步實驗研究。

鹽酸氨溴索作為一種黏液調(diào)節(jié)劑在臨床上應(yīng)用多年,已有不少研究證實〔11〕,鹽酸氨溴索可通過抗氧化、減輕炎癥介質(zhì)促進(jìn)肺表面活性中磷脂合成等作用發(fā)揮對ALI的保護(hù)作用。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相符。然而與ALI過程有關(guān)的機制眾多,研究表明〔12〕,肺血管重塑在ALI的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果說明,LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺血管重塑病癥明顯。研究發(fā)現(xiàn)〔13〕,肺血管重塑是呼吸系統(tǒng)中復(fù)雜的生理過程,由眾多因素參與,α-SMA和VEGF在這一過程中發(fā)揮了重要作用。α-SMA作為肌動蛋白的一種,具有收縮能力并且富含大量微絲的胞內(nèi)蛋白,可以調(diào)控肺血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換〔14〕,α-SMA表達(dá)量可以有效反映ALI肺部纖維化程度〔15〕。據(jù)報道〔16〕,作為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的促進(jìn)因子,VEGF可表達(dá)于肺平滑肌細(xì)胞,并參與多條信號通路信號傳導(dǎo),是平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的重要參與者,也是ALI大鼠肺動脈發(fā)生重塑的關(guān)鍵。本研究結(jié)果說明,鹽酸氨溴索對ALI大鼠肺部的保護(hù)作用可能與改善肺部血管重塑狀態(tài)有關(guān)。

研究表明〔17〕,細(xì)胞凋亡與肺細(xì)胞血管重塑緊密相關(guān),激活凋亡基因能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而排出體外,細(xì)胞增殖有利于修復(fù)受損的肺組織,實現(xiàn)細(xì)胞增殖和凋亡的平衡,從而保障血管壁細(xì)胞健康。而一旦細(xì)胞凋亡與增殖的平衡被破壞,肺血管細(xì)胞大量增殖且細(xì)胞凋亡速率減弱,會導(dǎo)致細(xì)胞大量累積,進(jìn)而出現(xiàn)血管重塑。本研究結(jié)果說明,肺動脈平滑肌細(xì)胞與血管重塑相關(guān)。細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑均由線粒體介導(dǎo),也稱凋亡途徑是線粒體路徑。有研究指出〔18〕,ALI大鼠肺組織細(xì)胞線粒體膜電位異常改變。Bax作為的促凋亡程序的主要參與者,可通過競爭性抑制抗凋亡蛋白活性,從而破壞線粒體路徑〔19〕,基質(zhì)長期處于高滲透狀態(tài)下會導(dǎo)致線粒體膜損傷進(jìn)而破裂,此階段細(xì)胞質(zhì)中會有大量的促凋亡蛋白,而Caspase蛋白酶家族會其發(fā)生酶解級聯(lián)反應(yīng),而隨著Caspase蛋白酶的激活會導(dǎo)致DNA受損,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而作為抗凋亡蛋白的Bcl-2能夠與線粒體膜上的結(jié)合蛋白發(fā)生聯(lián)級反應(yīng),避免細(xì)胞膜受損。相關(guān)研究顯示,釋放調(diào)控Bcl-2/Bax信號,能夠限制細(xì)胞凋亡,緩解ALI大鼠模型的血管重塑〔20〕。本研究結(jié)果說明,調(diào)控線粒體途徑的相關(guān)蛋白表達(dá)水平可受鹽酸氨溴索調(diào)控,從而降低肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而改善肺血管重塑狀態(tài),發(fā)揮對ALI大鼠肺部的保護(hù)作用。

綜上,肺平滑肌細(xì)胞可通過鹽酸氨溴索降低凋亡率并對其血管重塑有改善作用,進(jìn)而減少ALI肺組織損傷。但鹽酸氨溴索在臨床的實際應(yīng)用效果,仍需深入研究。