趙麗麗 張碩 張洋 王鵬 姜立剛

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132000;2北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

家族性帕金森病(PD)通常與遺傳基因存在一定的相關(guān)性,因此表現(xiàn)出一定的家族聚集性和區(qū)域性。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種基因與該疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),如MAPT基因〔1〕、SNCA基因〔2〕及LRRK2基因〔3,4〕等,其中,LRRK2基因突變與PD的易感性的相關(guān)性已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。隨著研究的深入,LRRK2基因越來越多的突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)LRRK2基因突變位點(diǎn)種類具有很強(qiáng)的地域差異性,如p.G2385R、p.A419V等突變位點(diǎn)在亞洲人種族中被發(fā)現(xiàn)〔5〕,而p.M1646T僅在高加索人中發(fā)現(xiàn)〔6〕;不僅如此,在不同人種中LRRK2基因突變位點(diǎn)頻率也有所區(qū)別,如p.R1398H突變位點(diǎn)在高加索人種中占約7%,而在亞洲人種族中占10%〔7〕。因此,雖然目前針對(duì)LRRK2基因突變對(duì)家族性PD易感性的關(guān)系已經(jīng)有了部分研究〔8～10〕,但是對(duì)于漢族人種、尤其是吉林白山地區(qū)漢族人種的LRRK2基因突變類型及對(duì)家族性PD易感性的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

本研究通過基因測(cè)序并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段研究漢族家族性PD患者的LRRK2基因突變類型及在家族性PD患者中的分布頻率,并與漢族非PD患者分布頻率進(jìn)行比較,以確定在吉林省白山地區(qū)LRRK2基因突變類型分布頻率,并重點(diǎn)探討LRRK2基因G2385R突變與家族性PD易感性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 Taq DNA聚合酶、dNTP及血液提取試劑盒購自大連TaKaRa公司;LRRK2基因目標(biāo)擴(kuò)增序列來源于NCBI網(wǎng)站,基因擴(kuò)增引物由上海英俊公司訂購,Sanger測(cè)序由上海華大基因測(cè)序公司完成;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀器購自杭州朗基科技股份有限公司;凝膠成像儀器購自上海天能科技股份有限公司。

1.2研究對(duì)象 于2017年1月至2022年12月在吉林省白山市、撫松縣收集,并經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院及北華大學(xué)附屬醫(yī)院確診的58例漢族家族性PD患者為試驗(yàn)組,并隨機(jī)選擇了58例漢族的非PD患者的健康體檢者為對(duì)照組。試驗(yàn)組中男31例,平均年齡(66.1±10.7)歲,平均患病時(shí)間為(7.2±5.1)年;女27例,平均年齡為(69.1±12.9)歲,患病時(shí)間為(8.4±6.5)年。對(duì)照組男31例,平均年齡(68.35±8.64)歲;女27例,平均年齡(68.76±10.48)歲。兩組年齡及性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。試驗(yàn)組入選標(biāo)準(zhǔn)是必須符合PD臨床癥狀包含靜止性震顫、動(dòng)作遲緩及肌肉僵直3項(xiàng)指標(biāo)中的兩項(xiàng)以上,而對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)為不符合PD臨床癥狀包含靜止性震顫、動(dòng)作遲緩及肌肉僵直3項(xiàng)指標(biāo)中2項(xiàng)以上的健康體檢者,同時(shí)采用磁共振成像(MRI)進(jìn)行診斷明確分組。參與研究的對(duì)象均經(jīng)本人同意并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3樣本提取 抽取試驗(yàn)組和對(duì)照組研究對(duì)象的靜脈血5 ml,存于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,取0.2 ml用于全血基因組DNA提取,剩余血液存放于-70 ℃冰箱。全血基因組DNA提取步驟參照血液提取試劑盒(TaKaRa公司)說明書,提取后的基因組DNA存放于-30 ℃冰箱以備實(shí)驗(yàn)使用。

1.4基因型檢測(cè) 研究〔5〕發(fā)現(xiàn),在吉林白山地區(qū)的LRRK2基因突變類型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4類。本研究針對(duì)該4種突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,將樣本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,取經(jīng)驗(yàn)證的產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序采用Primer5.0設(shè)計(jì)引物,分別擴(kuò)增的G2019S(上游引物：5′-TGCTGCCATCATTGCAAAGATTG-3′,下游：5′-TCCCCATTCTACAGCAGTACTGA-3′)、K616R(上游引物：5′-CTTCCTTCCCACCAACAGG-3′,下游：5′-TGTCCATCAAAGTCACAGAGAG-3′)、R1441C(上游引物：5′-AGCAGGCCCAGTTTGAAAG-3′,下游：5′-G ACATTTCTAGGCAGTTGAGAATC-3′)和G2385R(上游引物：5′-GCACAGAATTTTTGATGCTTG-3′,下游：5′-GAGGTCAGTGGTTATCCATCC-3′)4個(gè)突變位點(diǎn)。50 μl反應(yīng)體系對(duì)以上4個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系包含1×緩沖液、1 μmol/L上游引物/下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、0.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP),最后加入1 μl全血提取的基因組DNA,最后放入PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。程序結(jié)束后取3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2%)分析,驗(yàn)證合格后送經(jīng)上海華大基因進(jìn)行Sanger測(cè)序,以對(duì)LRRK2基因上的4個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5磁共振成像(MRI)分析 采用Trio 1.5 T MRI系統(tǒng)(Siemens,Erlangen,Germany)進(jìn)行MRI分析,患者在整個(gè)掃描過程中被要求安靜、閉眼、情緒放松且大腦放空狀態(tài),圖像采用平面回波成像(EPI)收集。層厚3 mm,矩陣256×256,視場(chǎng)24×24;EPI順序?yàn)榛夭〞r(shí)間(TE)2.98 ms,重復(fù)時(shí)間(TR)2 300 ms,反轉(zhuǎn)時(shí)間(TI)450.0 ms,反轉(zhuǎn)角度9 °,平均次數(shù)(NEX)1,厚 1 mm。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Sanger測(cè)序結(jié)果采用Chromas2.4軟件分析并統(tǒng)計(jì)基因突變型的基因分布,采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1測(cè)序結(jié)果及LRRK2基因突變型分布頻率 p.G2385R基因突變型在漢族人群中所占的比例較大,且試驗(yàn)組LRRK2基因突變位點(diǎn)p.G2385R顯著高于對(duì)照組(χ2=4.209,P<0.05),其他3組無顯著性差異(均P>0.05)。見表1。

表1 LRRK2基因的基因突變型頻率分布〔n(%),n=58〕

2.2MRI結(jié)果 試驗(yàn)組小腦、腦干未見萎縮,橋前池?zé)o增寬第四腦室未見擴(kuò)張。均可除外PD綜合征;雙側(cè)基底節(jié)、放射冠、腦干及小腦未見異常信號(hào)均可除外多發(fā)性腦梗死,更利于排除PD綜合征的診斷。見圖1。

圖1 1例試驗(yàn)組患者全腦軸向切片MRI

3 討 論

LRRK2蛋白是一種由2 527個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多功能域的蛋白,目前發(fā)現(xiàn)的多中突變形式,而這些突變位點(diǎn)多與疾病的發(fā)生發(fā)展存在某種聯(lián)系,如神經(jīng)退行性疾病PD就與該基因的某些突變存在相關(guān)性,已經(jīng)有研究證明,LRRK2基因某些多態(tài)性突變位點(diǎn)與發(fā)散性PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性〔11〕。LRRK2基因某些多態(tài)性突變位點(diǎn)在PD發(fā)病過程中起著決定性作用,因此可以作為PD的易感基因。

研究〔5〕發(fā)現(xiàn),在吉林白山地區(qū)的LRRK2基因突變類型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4類。本研究中針對(duì)該4種突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,將樣本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,取經(jīng)驗(yàn)證的產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序,結(jié)果顯示家族性PD患者中p.G2385R突變型高出非PD患者2.21倍,提示通過人LRRK2基因p.G2385R突變位點(diǎn)的檢測(cè)可能能夠預(yù)測(cè)該攜帶者患有家族性PD的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)而給予早期關(guān)注和可能的干預(yù)。p.G2385R突變位點(diǎn)位于WD40功能區(qū)域,該功能域能夠參與LRRK2蛋白的二聚體化,因此在區(qū)域發(fā)生突變后由于能夠影響LRRK2蛋白的二聚體化而降低該蛋白激酶功能域的活性〔12〕。但是由于LRRK2蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)是一個(gè)十分復(fù)雜的生物信號(hào)轉(zhuǎn)化作用,雖然p.G2385R位點(diǎn)發(fā)生突變后,WD40功能區(qū)域如何發(fā)生構(gòu)象變化及LRRK2蛋白如何導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能的異常還有待深層次的研究,但是p.G2385R突變位點(diǎn)能夠作為一種易感基因標(biāo)志物來評(píng)價(jià)攜帶者患家族性PD的風(fēng)險(xiǎn),也為臨床家族性PD診斷和治療提供一種新的方式。