徐璐娜，周玉芳，阮洪生，陳 云，王翰華，王又迪

（1.浙江藥科職業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院，寧波 315503；2.浙江醫(yī)院藥劑科，杭州 310013）

糖尿病足是老年糖尿病患者致殘的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一[1]。現(xiàn)階段中醫(yī)對糖尿病足的體外治療，主要采取的處理方法有中藥足療熏洗、中藥外敷涂抹等[2-4]。糖足散是浙江醫(yī)院中醫(yī)科應(yīng)用多年的協(xié)定處方，由紅花等9 味中藥組成。方中紅花、當(dāng)歸、牛膝溫通散寒、活血化瘀，合為君藥。桂枝、醋乳香、細(xì)辛辛溫通絡(luò)，配合君藥散寒活血，三藥為臣。赤芍，清熱涼血，發(fā)揮佐制之用。鳳仙透骨草、桑枝引諸藥透入經(jīng)絡(luò)、血脈，通達(dá)四肢而祛風(fēng)、活血、止痛。糖足散熏洗患者足部能擴張血管內(nèi)徑，加快患肢血液運行，改善足部微循環(huán)，用糖足散協(xié)助彌可保治療早期糖尿病足，臨床療效顯著[5]。本實驗對糖足散進行了初步的定性定量研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善與提升提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BK6000 型顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；Good Look-2000 型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?；UV-6100 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；FA2004 型電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-2 型恒溫數(shù)顯水浴鍋（常州國華電器有限公司）；HY-08 型高速粉碎機（北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司）。

1.2 材料

當(dāng)歸、紅花、牛膝對照藥材（批號：120927-201617、120907-201412、121066-201809），β-蛻皮甾酮、人參皂苷Ro 對照品（批號：111638-201706、111903-201604）均購自中國食品藥品檢定研究院；蘆丁對照品（批號：B20771，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；中藥飲片均購自杭州華東飲片有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 mg/L、3,5-二硝基水楊酸試液（Phygene）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 糖足散樣品制作

稱取當(dāng)歸、紅花等中藥飲片適量，分別粉碎成粉末（過3 號篩），按糖足散處方中比例（當(dāng)歸、赤芍、牛膝、桂枝、透骨草各18 g、桑枝24 g、紅花12 g、醋乳香10 g、細(xì)辛6 g）混勻，即得糖足散樣品。

2.2 顯微鑒別[6]

取糖足散樣品粉末適量，制片、觀察，并描述其顯微特征。本品粉末紅棕色，花粉粒類圓形或橢圓形，直徑約60μm，外壁具有短刺和點狀雕紋，3 個萌發(fā)孔（紅花）；石細(xì)胞呈類圓形、類方形或類長方形，壁一面菲?。ü鹬?，或壁厚，胞腔小（桑枝）；草酸鈣方晶，直徑5～20μm（桑枝），草酸鈣簇晶，直徑15～30μm（赤芍）；不規(guī)則團塊無色或淡黃色，表面及周圍擴散出眾多細(xì)小顆粒，久置溶化（醋乳香）；非腺毛由多個細(xì)胞構(gòu)成，部分細(xì)胞內(nèi)含棕色物質(zhì)（鳳仙透骨草）。詳見圖1。

圖1 糖足散顯微特征(40×)

2.3 薄層鑒別

2.3.1 陰性樣品制作

按“2.1”項下方法，分別制作缺當(dāng)歸、缺紅花、缺牛膝、缺赤芍、缺桂枝、缺細(xì)辛的陰性樣品。

2.3.2 當(dāng)歸[6]

取糖足散樣品4 g（含當(dāng)歸0.5 g），加乙醚50 mL，回流提取1 h，取濾液，低溫?fù)]干，加乙醇1 mL 溶解殘渣，即得供試品溶液。取缺當(dāng)歸的陰性樣品3.5 g，當(dāng)歸對照藥材0.5 g，按上述方法分別制備陰性樣品溶液、對照藥材溶液。吸取上述溶液各5 μL，按序點于同一硅膠G 薄層板，展開系統(tǒng)選正己烷-乙酸乙酯（4∶1），于365 nm 紫外光燈下觀察。

2.3.3 紅花[6]

取糖足散樣品5.9 g（含紅花0.5 g），加80%丙酮溶液20 mL，超聲20 min，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺紅花的陰性樣品5.4 g，紅花對照藥材0.5g，按上述方法分別制備陰性樣品溶液、對照藥材溶液。吸取上述溶液各20 μL，按序點于同一硅膠H 薄層板，展開系統(tǒng)選乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4），于日光下觀察。

2.3.4 牛膝[6]

取糖足散樣品10 g（含牛膝1.3 g），加80%甲醇100 mL，回流提取4 h，取濾液，蒸干，加溫水5 mL 溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至D101 型大孔吸附樹脂柱，用水、20%乙醇各100 mL 先后洗脫柱子（棄洗脫液），再用80%乙醇100 mL 洗脫，收集、蒸干洗脫液，加80%甲醇1 mL 溶解殘渣，即得供試品溶液。取缺牛膝的陰性樣品8.7 g、牛膝對照藥材1.3 g，按上述方法分別制備陰性樣品溶液，對照藥材溶液。再取β-蛻皮甾酮對照品、人參皂苷Ro 對照品，加甲醇分別制成0.5 mg/mL 的對照品溶液。吸取上述溶液各15 μL（對照品溶液10 μL），點于同一硅膠G 薄層板，展開系統(tǒng)選二氯甲烷-甲醇-水-甲酸（14∶6∶1∶0.1），5%香草醛硫酸溶液噴淋，105℃加熱，斑點呈色清晰后觀察。

2.3.5 薄層鑒別結(jié)果

當(dāng)歸、紅花、牛膝薄層色譜圖中，主斑點清晰，陰性無干擾。詳見圖2～4。

圖2 當(dāng)歸薄層色譜

圖3 紅花薄層色譜

圖4 牛膝薄層色譜

2.4 糖足散總黃酮含量測定

2.4.1 對照品溶液制備

取蘆丁對照品（純度：98%）11.5 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加70%乙醇40 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度為0.2254 mg/mL）。

2.4.2 供試品溶液制備

取糖足散3 g，精密稱定，置250 mL 錐形瓶中，加水135 mL（料液比1∶45），浸泡30 min，水浴加熱回流提取0.5 h，提取液減壓抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。

2.4.3 樣品測定

精密移取待測溶液2mL 于25mL 容量瓶中，加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1mL，混勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min。以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[6]，在310nm波長下檢測。

2.4.4 檢測波長的選擇

精密量取“2.4.1～2.4.2”項下對照品溶液3 mL、供試品溶液2 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，按“2.4.3”項下方法，自“加水至6 mL”開始，依法操作，在250～600 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)在310 nm 波長處有較大的吸收且信號較穩(wěn)定。綜合考慮后，最終選用310 nm 作為本實驗最終檢測波長。

2.4.5 正交試驗考察水提工藝

在水浴工作狀態(tài)下，設(shè)計四因素三水平L9（34）正交試驗，考察料液比（1∶25、1∶35、1∶45）、浸泡時間（30、60、90 min）、提取溫度（80、90、100℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5 h）對糖足散中總黃酮含量的影響，最終以直觀分析結(jié)果結(jié)合節(jié)能高效的原則，確定了最佳提取參數(shù)，即液料比1∶45，浸泡時間30 min，提取溫度100℃，提取時間0.5 h。

2.4.6 線性關(guān)系考察

精密移取“2.4.1”項下對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL 分別置于25 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為9.02、18.03、27.05、36.06、45.08、54.10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按“2.4.3”項下方法測定，用吸光度、對照品質(zhì)量濃度分別作縱、橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=0.019 4X+0.007 5（R2=0.999）。蘆丁在9.02～54.10 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度試驗

精密移取蘆丁對照品溶液3 mL，按“2.4.3”項下方法，重復(fù)測定6 次。結(jié)果對照品溶液吸光度RSD 為0.39%，表明該儀器精密度良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗

精密移取同一份供試品溶液6 份，每份2 mL，按“2.4.3”項下方法測定吸光度，計算得到總黃酮百分含量RSD 為1.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗

分別精密移取對照品溶液3 mL、供試品溶液2 mL，按“2.4.3”項下方法操作，分別于0、10、20、30、40、50 min 測定。結(jié)果對照品溶液、供試品溶液吸光度RSD 分別為1.82%、0.80%，表明50 min 內(nèi)上述兩種溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.10 加樣回收率試驗

稱取已知含量的糖足散粉末0.15g，共6 份，置于25 mL 錐形瓶中，分別加入蘆丁對照品適量，加水13.5 mL，浸泡30 min，水浴加熱回流提取0.5 h，提取液減壓抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得供試品溶液，測定吸光度，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 總黃酮回收率結(jié)果（n=6）

2.4.11 樣品含量測定

稱取3 g 糖足散粉末3 份，按“2.4.2”項下供試品溶液制備法制備，按“2.4.3”項下方法操作測定。結(jié)果樣品中總黃酮平均含量為3.042%（RSD=2.00%）。

2.5 糖足散多糖含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L），按需求稀釋。

2.5.2 供試品溶液的制備

2.5.2.1 單糖供試品溶液的制備

稱取糖足散50 mg 于50 mL 容量瓶中，加超純水適量，振搖使溶解，用超純水定容至刻度，搖勻，用直徑0.80 μm 的濾膜濾過，取續(xù)濾液即得，備用。

2.5.2.2 總糖供試品溶液的制備

稱取糖足散50 mg 于100 mL 磨口三角瓶中，先加鹽酸（1→2）20 mL，置沸水浴中10 min，取出，靜置，待放冷后用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至中性，然后移入100 mL 的容量瓶中，用純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻，用直徑為0.80 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液25 mL 至50 mL 容量瓶中，用純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻即得，備用。

2.5.3 樣品測定

精密量取待測溶液4mL，置于20mL 具塞比色管中，加入DNS 試液2mL，搖勻，放置沸水浴中加熱7min，取出后放入冰水中冷卻至室溫，加純凈水6mL，搖勻，平行作空白，按照紫外分光光度法[6]，在515nm波長下檢測。

2.5.4 檢測波長的選擇

分別精密量取“2.5.1～2.5.2”項下對照品溶液適量、單糖溶液與總糖溶液各4 mL，置于20 mL 的具塞刻度試管中，分別按照“2.5.3”項下方法，自“加入DNS試液2mL”開始，依法操作，在470～700 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描。結(jié)果顯示三種溶液在515 nm 左右波長下有最大吸收。綜合考慮后，選用515 nm 作為檢測波長。

2.5.5 DNS 用量的考察

取5 支20 mL 具塞比色管，分別精密加入葡萄糖對照品溶液1 mL，補純凈水至4 mL，分別準(zhǔn)確加入DNS 試液1、2、3、4、5 mL，放入沸水浴中加熱5 min，取出后立即用冰水浴冷卻至室溫，加純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻后測定各自吸光度。詳見圖5。當(dāng)用量為2 mL 時，吸光度已達(dá)最大值。

圖5 DNS 用量與吸光度的關(guān)系

2.5.6 反應(yīng)時間考察

精密量取葡萄糖對照品溶液1 mL 至20 mL 比色管中，分別補純凈水至4 mL，加入DNS 試液2 mL，分別放入沸水浴中1、3、5、7、9 min，取出后立即用冰水浴冷卻至室溫，加純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻后測定各自吸光度。詳見圖6。由圖6 可知，顯色反應(yīng)時間為7 min 時，測定的吸光度值達(dá)到最大，故選7 min為本實驗最佳顯色反應(yīng)時間。

圖6 顯色時間與吸光度的關(guān)系

2.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L）1、1.5、2、2.5、5、6.25mL 于25mL 容量瓶中，依次加純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻，即得。精密量取不同濃度對照品溶液各4 mL，按照“2.5.3”項下方法測定，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，回歸方程為：Y=5.112 9X-0.200 5（R2=0.999 8），表明葡萄糖在0.04～0.25 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.8 精密度試驗

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L）2.85 mL，置于25 mL 容量瓶中，加純凈水稀釋，定容至刻度，得所需對照品溶液。按樣品測定方法重復(fù)測定6 次。結(jié)果對照品溶液吸光度RSD 為0.18%，表明該儀器精密度良好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗

分別精密量取對照品溶液（按精密度試驗項下的對照品溶液配制）、單糖溶液、總糖溶液各4 mL，按照樣品測定方法測定，于0～50 min 內(nèi)每隔10 min 測定1 次，結(jié)果各組溶液吸光度RSD 值均≤2%，可認(rèn)為3種溶液在50 min 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.10 重復(fù)性試驗

精密移取同一份單糖供試品溶液6 份，每份4 mL，分別置于20 mL 的具塞比色管中，按照樣品測定方法測定，總糖供試品溶液的測定操作同上。結(jié)果單糖溶液吸光度RSD 為1.92%；總糖溶液吸光度RSD為1.58%，顯示該方法重復(fù)性良好。

2.5.11 加樣回收率試驗

2.5.11.1 單糖加樣回收率試驗

對照品溶液配制：精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L）1.70 mL，置于25 mL 容量瓶中，加純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻即得，備用。配制糖足散單糖溶液6 份，分別移取2 mL 單糖樣品溶液置于20 mL 的具塞比色管中，分別加入2 mL 對照品溶液，按照樣品測定方法測定。測得單糖平均回收率為98.19%，RSD 為2.32%，結(jié)果見表2。

表2 單糖回收率結(jié)果（n=6）

2.5.11.2 總糖加樣回收率試驗

對照品溶液配制：精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L）2.85 mL，置于25 mL 容量瓶中，加純凈水稀釋，定容至刻度，搖勻即得，備用。配制糖足散總糖溶液6 份，分別移取2 mL 總糖樣品溶液置于20 mL 的具塞比色管中，分別加入2 mL 對照品溶液，按照樣品測定方法測定。測得總糖平均回收率為103.03%，RSD 為1.77%，結(jié)果見表3。

表3 總糖回收率結(jié)果（n=6）

2.5.12 樣品多糖含量測定

按“2.5.2”項下分別制備單糖供試品溶液和總糖供試品溶液各6 份，按照樣品測定方法測定，依法顯色，測定吸光度并計算各自含量，再按“多糖含量=（總糖含量-單糖含量）×0.9”計算多糖含量。結(jié)果樣品中單糖的平均含量為7.470%（RSD=3.00%），總糖的平均含量為46.423%（RSD=2.79%），代入上式，算得多糖含量為35.058%。

3 討論

顯微鑒別中，透化技術(shù)的靈活運用是鏡下觀察清晰與否的關(guān)鍵。試驗中發(fā)現(xiàn)對于只需微透化的樣品，滴水合氯醛試液后，可嘗試略過加熱步驟，放置片刻，待其自然透化后再行觀察，有時得到的效果會更佳。另外，因糖足散中當(dāng)歸的紡錘形韌皮薄壁細(xì)胞相對不易找到，故暫未納入本文。

薄層鑒別中發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫濕度對薄層展開有一定影響。試驗前期，牛膝薄層展開環(huán)境溫度過高，分離不理想，后改在陰涼室中進行，分離度便有所改善。濕度會影響硅膠薄層板的吸附能力，建議使用前對硅膠板進行活化，使板內(nèi)水分含量保持相對一致，盡量減少對Rf 值重現(xiàn)性的影響。此外牛膝薄層中還發(fā)現(xiàn)，因供試品中含較多水溶性雜質(zhì)，不可貪圖方便，省略過柱洗脫環(huán)節(jié)，否則易出現(xiàn)斑點粘連，各組分難以分離的情況。

黃酮類化合物是一類重要的天然產(chǎn)物，糖足散中多味藥材富含黃酮類成分，具抗炎、抑菌等作用[7-9]，對治療糖足潰瘍有一定的療效，故將總黃酮作為評價糖足散質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。測定黃酮類化合物含量的方法常見的有高效液相色譜法、紫外分光光度法，但高效液相色譜法更適合單體化合物的分離，因此，采用紫外分光光度法測定糖足散中總黃酮的含量[10]。

糖足散中多味藥材含多糖類成分，有抗炎抑菌、抗氧化、抗凝血等活性，可能是治療糖尿病足的有效組分，故把多糖作為糖足散的一個質(zhì)控指標(biāo)[11-14]。目前測定多糖的比色法有很多，常見的是蒽酮-硫酸比色法和苯酚-硫酸比色法，但這兩種方法存在缺陷，因單糖類雜質(zhì)也會與苯酚或蒽酮反應(yīng)，致使測定結(jié)果偏高[15]。另外蒽酮-硫酸比色法，其穩(wěn)定性受測定條件影響較大（如蒽酮試劑不易保存）[16]。DNS 法測定結(jié)果受雜質(zhì)干擾較小，可排除單糖等雜質(zhì)帶來的誤差，且DNS 試劑穩(wěn)定性較好，因而選擇DNS 法測定糖足散多糖[17]。

本文通過定性定量分析，對糖足散質(zhì)量控制方法進行了初步研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)，也為臨床安全用藥提供保障。