閆秋穎，張曉然，劉思遠(yuǎn)，郭軒桐，楊浩然，朱 琳

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院?遼寧 沈陽?110034）

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為β 淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)沉積及Tau 蛋白過度磷酸化，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞丟失。線粒體分裂和融合之間的動態(tài)平衡對于維持線粒體形狀和功能至關(guān)重要。研究證實，線粒體分裂融合異?？梢鸺?xì)胞凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞丟失[1]。

芪類是具有生物活性的天然產(chǎn)物，主要以白藜蘆醇及其在葡萄中發(fā)現(xiàn)的衍生物紫檀芪為代表[2]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過抑制AD 模型小鼠細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3]。紫檀芪為白藜蘆醇的衍生物，具有更好的脂溶性和生物利用度[4]。本研究主要考察了紫檀芪和白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的作用機制，以闡明它們在AD 治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 動物造模與分組

昆明雄性小鼠(18～25 g)，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物生產(chǎn)使用許可證號: SCXK(遼)–2015–0001。動物實驗經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會(SYYXY2019050801)批準(zhǔn)。側(cè)腦室注射3μL (含9nmol)聚集態(tài)Aβ25-35進(jìn)行造模。將小鼠隨機分為對照組、模型組、紫檀芪組(40mg?kg-1)和白藜蘆醇組(40mg?kg-1)，實驗流程如圖1A。

圖1 紫檀芪和白藜蘆醇對小鼠新物體辨別實驗的影響

1.2 新物體辨別實驗

新物體辨別實驗分為適應(yīng)階段和測試階段。適應(yīng)階段：在灌胃第5d 時，將小鼠放于開放場內(nèi)，讓其自由探索5min，以適應(yīng)環(huán)境。第6d 進(jìn)行測試（包括訓(xùn)練和檢測階段）。訓(xùn)練階段：記錄小鼠5min 內(nèi)自由探索物體的時間(tA1、tA2)。檢測階段：間隔1 h 后，將物體A2 換成形狀、材質(zhì)、顏色等完全不同的新物體B，記錄小鼠5min 內(nèi)自由探索不同物體的時間(tA1、tB)。優(yōu)先指數(shù)=tA2/(tA1+tA2)×100%or tB/(tA1+tB)×100%。

圖2 紫檀芪和白藜蘆醇對小鼠神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的影響

圖3 紫檀芪和白藜蘆醇對小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

1.3 免疫熒光實驗

將冰凍切片室溫復(fù)溫10min，滴加0.3% TritonX–100 室溫孵育30min，10%山羊血清封閉液37°C 孵育60min，滴加兔抗NeuN 抗體后4°C 孵育過夜。滴加山羊抗兔IgG-Cy3 二抗(1∶500)，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.4 透射電鏡實驗

小鼠麻醉后完全暴露心臟，用生理鹽水進(jìn)行灌流后灌入灌流液(4%多聚甲醛∶2.5%戊二醛=1∶1)。取小塊皮層組織，加入1%鋨酸固定2 h，漂洗后乙醇脫水，用Epon812 對組織浸透聚合包埋，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后透射電鏡拍照。

1.5 Westernblot 實驗

將小鼠皮層組織均漿，取30μg 進(jìn)行SDS 聚丙烯凝膠電泳。加入兔抗NeuN，小鼠抗β-actin,兔抗Bcl-2 或Bax 抗體，4°C 孵育過夜。加入山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG 抗體(1∶10000)室溫孵育2h，采用ECL 發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.6 Real-time RT-PCR 實驗

利用Trizol 試劑提取皮質(zhì)組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。利用SYBR Green 試劑盒以GAPDH 作為內(nèi)參進(jìn)行real-time RT-PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：95℃30 s；52℃30 s；72℃60 s，共40 個循環(huán)，使用2-△△Ct方法計算每組之間相對mRNA 的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，不同組間采用單因素方差(one-way ANOVA)分析檢測數(shù)據(jù)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪和白藜蘆醇對AD 模型小鼠形象辨別能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，各組小鼠對物體的探索總時間無顯著差異。在訓(xùn)練階段，各組小鼠對物體A2 的優(yōu)先指數(shù)無顯著差異。與模型組相比，給藥后均可顯著提高小鼠檢測階段的新物體辨別優(yōu)先指數(shù)。

2.2 紫檀芪和白藜蘆醇對AD 模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的影響

與對照組相比，模型組小鼠皮層NeuN 熒光強度和蛋白質(zhì)水平顯著降低。與模型組相比，給藥后小鼠NeuN 熒光強度和蛋白質(zhì)水平均增加。詳見圖2。

2.3 紫檀芪和白藜蘆醇對AD 模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)向核膜邊聚集呈塊狀，同時凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax 顯著降低。給藥后可逆轉(zhuǎn)上述神經(jīng)細(xì)胞核形態(tài)，增加Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)，詳見圖3。

2.4 紫檀芪和白藜蘆醇對AD 模型小鼠線粒體動力學(xué)的影響

與對照組相比，模型組小鼠皮層組織Drp1、Opa1和MFN1 基因的mRNA 水平顯著降低。紫檀芪或白藜蘆醇處理可分別顯著增加線粒體分裂基因Drp1 和融合基因Opa1 的mRNA 水平，詳見圖4。

圖4 紫檀芪和白藜蘆醇對小鼠線粒體分裂融合相關(guān)基因的影響

3 討論

白藜蘆醇作為天然的芪類衍生物受到廣泛的關(guān)注，在缺血性腦損傷、學(xué)習(xí)記憶及抗腫瘤等方面均發(fā)揮重要作用。紫檀芪為白藜蘆醇的甲基化衍生物，具有抗腫瘤、抗氧化和抑菌等多種生物活性，且具有更高的生物利用度[4,5]。因此，白藜蘆醇和紫檀芪在AD中的作用值得深入研究。

線粒體上的Bcl-2 家族蛋白由促存活和促凋亡成員組成，可決定細(xì)胞生存或死亡。研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪和白藜蘆醇改善了Aβ25-35誘導(dǎo)的AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，增加皮層神經(jīng)細(xì)胞量。同時，改善神經(jīng)細(xì)胞核的形態(tài)，上調(diào)Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究證實，紫檀芪處理后主要增加AD 模型小鼠線粒體分裂基因Drp1 表達(dá)，而白藜蘆醇主要增加融合基因Opa1 表達(dá)。

綜上所述，紫檀芪和白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)線粒體動態(tài)平衡抑制細(xì)胞凋亡，改善AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。同時，本研究還證實紫檀芪和白藜蘆醇的保護(hù)機制可能分別與調(diào)節(jié)線粒體分裂和融合相關(guān)基因有關(guān)，為防治AD 的新藥開發(fā)提供了理論依據(jù)。