王曉慧，富 力，竇德強(qiáng)*，張明波*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，大連 116600；2.大連富生天然藥物開(kāi)發(fā)有限公司，大連 116600）

人參為五加科植物人參（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖[1]；紅參為五加科植物人參的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖；黑參為人參經(jīng)“九蒸九曬”的炮制品；西洋參為五加科植物西洋參(Panaxquinquefolium L.）的干燥根；人參葉為五加科植物人參的干燥葉。五種藥材都具有補(bǔ)氣的作用，人參臨床上用于治療氣血虧虛，脾虛食少，肢冷脈微等癥。紅參臨床應(yīng)用于體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血，崩漏下血等癥。西洋參主要作用為補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津，臨床上用于氣陰虧虛，虛熱煩倦，咳喘痰血等癥。人參葉具有補(bǔ)氣益肺，滋陰降火，生津止渴等功效。黑參作為一種新型炮制品，研究較少，但已有研究表明黑參具有抗癌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。由于脾為后天之本，人參的補(bǔ)脾作用與其大補(bǔ)元?dú)庀嚓P(guān)。有書(shū)籍中記載人參治療倦怠無(wú)力，食欲不振，嘔吐泄瀉等脾胃虛弱證（現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的消化系統(tǒng)疾病如十二指腸潰瘍）[3]，因此本文以脾氣虛的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病—疲勞與腸炎作為研究對(duì)象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究五種藥物治療脾氣虛的作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 研究策略及思路

本文的研究策略和思路大致如下，目的：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究五種藥物抗脾氣虛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，挖掘各藥材治療脾氣虛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。理論依據(jù)：①選擇與脾氣虛相關(guān)的疾病如疲勞、胃炎和腸炎的相關(guān)靶點(diǎn)作為五種藥物治療脾氣虛的可能作用靶標(biāo)。②中藥功效的科學(xué)內(nèi)涵可以通過(guò)共性效應(yīng)（群）—共性靶標(biāo)（群）—特征組分（群）加以表征。方法：①以五種藥物化學(xué)成分作為切入點(diǎn)，采用TCMSP、PubChem 與Swisstargetprediction 對(duì)其化學(xué)成分和靶點(diǎn)進(jìn)行發(fā)掘、預(yù)測(cè)。②利用GeneCards 查找脾氣虛相關(guān)疾?。ㄆ谂c腸炎）的靶點(diǎn)，將五種藥物的靶點(diǎn)分別與脾氣虛基因做交集得到藥物抗脾氣虛的作用靶點(diǎn)。③利用String 線上工具構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。④用R 軟件對(duì)各藥物靶標(biāo)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，并利用Cytoscape 繪制化學(xué)成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。⑤通過(guò)化合物、靶標(biāo)與通路的Degree 值與p-value 值篩選出治療脾氣虛的主要活性成分、主要靶標(biāo)與主要通路。具體過(guò)程如圖1 所示。

圖1 總體研究策略及思路

2 研究方法

2.1 各藥材成分及作用靶點(diǎn)的收集

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上，分別查找人參、紅參、西洋參和人參葉的主要活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)。其中口服生物利用度(OB)≥30%，類(lèi)藥性(DL)≥0.18。由于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄黑參，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲取黑參的主要活性成分。

2.2 各藥材化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在Swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)平臺(tái)中導(dǎo)入各藥材活性成分SMILES 格式進(jìn)行分析，設(shè)置屬性為“homosapiens”，將概率值大于0 的靶點(diǎn)作為該成分有效靶點(diǎn)。

2.3 脾氣虛疾病基因的收集以及交集基因的篩選

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取脾氣虛相關(guān)疾?。ㄆ谂c腸炎）的基因，將數(shù)據(jù)匯總后去除重復(fù)基因并查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得脾氣虛（疲勞與腸炎）的相關(guān)靶點(diǎn)。將五種藥材的靶點(diǎn)分別與脾氣虛疾?。ㄆ谂c腸炎）基因做交集得到交集基因韋恩圖。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及結(jié)構(gòu)構(gòu)建

在String PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)中導(dǎo)入疾病-藥物互作蛋白，選擇人類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)調(diào)整，設(shè)置評(píng)分值（置信度）>0.9 后，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)的蛋白互作信息導(dǎo)入軟件Cytoscape3.7.2，生成PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖(PPIN)。

2.5 藥材活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，通過(guò)Network Analyzer 工具分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，獲取對(duì)應(yīng)拓?fù)涠戎担╠egree），使用cytoscape 軟件cytohubba 插件對(duì)人參、紅參、黑參、西洋參和人參葉的活性成分-靶點(diǎn)連線結(jié)果進(jìn)行打分并作出可視化圖，獲取對(duì)應(yīng)拓?fù)涠戎担╠egree），篩選出五種藥材活性成分的潛在關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.6 藥材活性成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用Perl 計(jì)算機(jī)程序語(yǔ)言編寫(xiě)的腳本，在得到的藥物-疾病對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上生成藥物和疾病的連線和有效化學(xué)成分，使用Cytoscape3.7.2 作圖，顯示出藥物-化學(xué)成分-靶標(biāo)的互作網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行分析。提取網(wǎng)絡(luò)中的交集部分，即為五種藥材治療脾氣虛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.7 GO 富集分析

為了進(jìn)一步分析五種藥材所調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，將交集蛋白上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）分析，分別得到人參、紅參、黑參、西洋參和人參葉所涉及的生物學(xué)過(guò)程，并對(duì)所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2.8 KEGG 通路富集分析

將前面幾步所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，通過(guò)R 語(yǔ)言和Perl 語(yǔ)言作圖，比對(duì)有效基因及蛋白，并作出信號(hào)通路圖，整理歸類(lèi)得出結(jié)論，并將所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

3 結(jié)果

3.1 藥材有效成分及靶點(diǎn)信息的匯總分析

通過(guò)檢索中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，收集到不同藥材的有效成分及作用靶標(biāo)，其中人參的有效成分有79 個(gè)，紅參30 個(gè)，黑參17 個(gè)，西洋參27 個(gè)，人參葉27 個(gè)；與各藥材相關(guān)的靶點(diǎn)分別為人參671 個(gè)，紅參336 個(gè)，黑參176 個(gè)，西洋參291 個(gè)，人參葉258 個(gè)。表1 列出了各藥材中作用靶點(diǎn)數(shù)居于前十的成分信息。

表1 各藥物成分及靶點(diǎn)信息

3.2 五種藥材與脾氣虛疾病的交集靶點(diǎn)

將3.1 項(xiàng)下得到的五種藥材作用靶點(diǎn)分別與脾氣虛疾病靶點(diǎn)做交集得到靶點(diǎn)交集的韋恩圖，詳見(jiàn)圖2。人參與腸炎疾病的交集靶點(diǎn)共有537 個(gè)，紅參有279 個(gè)，黑參有157 個(gè)，西洋參有235 個(gè)，人參葉有208 個(gè)。根據(jù)得到的交集靶點(diǎn)可進(jìn)一步進(jìn)行靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，探究其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分。

圖2 五種藥材與腸炎的交集靶點(diǎn)韋恩圖

3.3 治療脾氣虛相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

利用SRTING 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)五種藥材治療脾氣虛的作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取綜合打分值大于0.9 的靶點(diǎn)，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建人參、紅參、黑參、西洋參和人參葉治療脾氣虛的PPI 網(wǎng)絡(luò)，如圖3 所示。其中MAPK1、STAT3、HSP90AA1、SRC、VEGFA、EGFR 在五種藥物的PPI 網(wǎng)絡(luò)中都具有很高的Degree 排名，可能為人參、紅參、黑參、人參葉、西洋參治療脾氣虛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 五種藥材活性成分作用靶點(diǎn)的核心PPI 圖

3.4 各藥材治療脾氣虛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

通過(guò)構(gòu)建藥物-疾病-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）得出，人參治療脾氣虛的化合物一共有78 個(gè)，與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)有537 個(gè)；紅參治療脾氣虛的化合物一共有26 個(gè)，與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)有279 個(gè)；黑參治療脾氣虛的化合物一共有16 個(gè)，與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)有157個(gè)，西洋參治療脾氣虛的化合物一共有27 個(gè)，與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)有236 個(gè)；人參葉治療脾氣虛的化合物一共有26 個(gè)，與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)有216 個(gè)。根據(jù)分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)并獲取對(duì)應(yīng)拓?fù)涠戎担―egree），選取Degree 大于等于10 的化合物與靶點(diǎn)作為藥物活性成分以及潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)表2）。

表2 各藥材治療腸炎有效成分Degree 值

圖4 五種藥材的有效成分與腸炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 各藥材治療腸炎靶點(diǎn)的GO 富集分析

通過(guò)對(duì)五種藥材作用靶點(diǎn)的GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，人參有117 個(gè)生物學(xué)功能，與治療腸炎關(guān)系密切的主要有nuclear receptor activity、ligand -activated transcription factor activity 與steroid hormone receptor activity 等；紅參有102 個(gè)生物學(xué)功能，與治療腸炎關(guān)系密切的主要有protein serine/threonine kinase activity、steroid hormone receptor activity 與nuclear receptor activity 等；黑參有78 個(gè)生物學(xué)功能，與治療腸炎關(guān)系密切的主要有protein serine/threonine kinase activity、nuclear receptor activity 與ligand-activated transcription factor activity 等；西洋參有25 個(gè)生物學(xué)功能，與治療腸炎關(guān)系密切的主要有DNA-binding transcription factor binding、transcription coregulator binding 與ltranscription coactivator binding 等；人參葉有19 個(gè)生物學(xué)功能，與治療腸炎關(guān)系密切的主要有iron ion binding、steroid hydroxylase activity 與monooxygenase activity 等。

3.6 各藥材治療腸炎靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

通過(guò)對(duì)五種藥材的作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，人參有195 條作用通路，其中與治療腸炎相關(guān)的信號(hào)通路主要有PI3K-Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Alzheimer disease 等；紅參有158 條通路，與治療腸炎相關(guān)的通路主要有Neuroactive ligand -receptor interaction、PI3K -Akt signaling pathway 與Lipid and atherosclerosis 等；黑參有149 條通路，與治療腸炎相關(guān)的通路主要有Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K -Akt signaling pathway與Calcium signaling pathway 等；西洋參有168 條通路，與治療腸炎相關(guān)的通路主要有Neuroactive ligand-receptor interaction、Chemical carcinogenesis-receptor activationr 與PI3K-Akt signaling pathway 等；人參葉有162 條通路，與治療腸炎相關(guān)的通路主要有PI3K-Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer及Chemical carcinogenesis -receptor activation 等。選取顯著性最高的前30 條通路，進(jìn)行可視化分析，詳見(jiàn)圖5。其中P 值代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高，點(diǎn)的大小對(duì)應(yīng)于條目中注釋的基因數(shù)。

圖5 五種藥材治療腸炎靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析圖

4 討論與結(jié)論

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此中藥的作用機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠反映出藥物成分間的協(xié)同作用，所以成為研究中藥作用機(jī)制的得力工具。有鑒于此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究人參、紅參、黑參、西洋參、人參葉治療脾氣虛的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。

通過(guò)KEGG 通路富集篩選，人參可通過(guò)Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號(hào)通路）、Lipid and atherosclerosis（脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化）、MAPK signaling pathway（MAPK 信號(hào)通路）等195 條通路治療脾氣虛。紅參可通過(guò)Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號(hào)通路）、cAMP signaling pathway（cAMP 信號(hào)通路）等158條通路治療脾氣虛。黑參可通過(guò)PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號(hào)通路）、Proteoglycans in cancer（癌癥中的蛋白聚糖）、Alzheimer disease（阿爾茨海默?。┑?49 條通路治療脾氣虛。西洋參可通過(guò)Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用）、Chemical carcinogenesis-receptor activation（化學(xué)致癌-受體激活）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號(hào)通路）等168 條通路治療脾氣虛。人參葉可通過(guò)PI3K-Akt signaling pathway（PI3KAkt 信號(hào)通路）、Proteoglycans in cancer（癌癥中的蛋白聚糖）、Chemical carcinogenesis-receptor activation（化學(xué)致癌-受體激活）、Alzheimer disease（阿爾茨海默病）等162 條通路治療脾氣虛。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用）信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的配體和受體的集合[4]。免疫系統(tǒng)發(fā)生異常會(huì)引起多種疾病，例如自身免疫病、慢性炎癥性疾病等。炎癥是一種機(jī)體應(yīng)對(duì)外界感染、組織損傷及其他細(xì)胞應(yīng)激的反應(yīng)，炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)引起多條信號(hào)通路的激活。研究表明[5]PI3K 信號(hào)通路廣泛存在于各種神經(jīng)細(xì)胞中，能夠激活或者抑制細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的磷酸化，調(diào)控神經(jīng)元的存活或者凋亡、自噬、神經(jīng)元增殖分化以及突觸可塑性等過(guò)程，例如神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病。STAT3 信號(hào)通路作為一條與炎癥、免疫等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是多種中藥的作用靶點(diǎn)[6,7]。馬翠翠[8]等發(fā)現(xiàn)STAT3 能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這與腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)生有關(guān)，巨噬細(xì)胞可激活STAT3途徑，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和不同的巨噬細(xì)胞表型，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡等過(guò)程中起重要作用，在多數(shù)腫瘤中STAT3 信號(hào)通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，這為治療腫瘤提供新的靶點(diǎn)。

脾為后天之本，氣血生化之源，人參、紅參、黑參、西洋參與人參葉皆屬于補(bǔ)氣類(lèi)中藥。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)人參、紅參、黑參、西洋參和人參葉治療脾氣虛的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，這五種藥材可能通過(guò)調(diào)配神經(jīng)系統(tǒng)、抑制細(xì)胞分裂周期、控制炎癥反應(yīng)等方面，發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路治療脾氣虛的作用。闡明五種藥材治療脾氣虛的作用機(jī)制，為五種藥材進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。但現(xiàn)階段網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍存在很多不足之處，比如數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)信息的準(zhǔn)確性和全面性有待提高；數(shù)據(jù)庫(kù)之間藥物成分及其靶點(diǎn)的相關(guān)性較低，應(yīng)加強(qiáng)主要數(shù)據(jù)庫(kù)之間的整合；蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步完善；網(wǎng)站的穩(wěn)定性仍有待加強(qiáng)等等，這就使研究結(jié)果可能存在一定的偏差性，所以還需要進(jìn)一步完善各數(shù)據(jù)庫(kù)。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物系統(tǒng)信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的有效成分，探索中藥治療疾病的作用機(jī)制，更好的發(fā)揮中藥在疾病治療中的作用，使中醫(yī)藥在國(guó)際上的影響力不斷加強(qiáng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方的作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的深入開(kāi)展和合理應(yīng)用值得期待。