戴向榮,梁杰,蔣濤,李剛,許雷鳴

[1.兆科藥業(yè)(合肥)有限公司,合肥 230088;2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院,合肥 230051]

目前抗血小板藥物根據(jù)不同的作用機(jī)制主要有環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)抑制劑,如阿司匹林;腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,adp)受體拮抗劑,如氯吡格雷;磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制劑,如雙嘧達(dá)莫、西洛他唑;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(platelet membrane glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa)受體拮抗劑,如替羅非班以及其他抗血小板藥物,如奧扎格雷[1-4]。

GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑主要作用于血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP),通過阻斷GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原結(jié)合阻止血小板聚集[5-8]。GP是介導(dǎo)血小板聚集的關(guān)鍵成分,GPIb是血小板表面最主要的糖蛋白之一,與GPⅡb/Ⅲa介導(dǎo)的粘附機(jī)制不同,它通常只介導(dǎo)在高剪切力作用下的粘附[9-11]。GPIb與血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)特異性結(jié)合,使血小板粘附到血管壁上,導(dǎo)致血小板聚集,引起血栓[12-13]。因此,通過阻斷GPIb與血漿vWF結(jié)合,可阻止血小板粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞壁上,抑制血小板聚集。這種阻斷作用不涉及凝血酶類及任何其他凝血因子,安全性高,將成為特異性更好的抗血栓藥物的新方向。

安菲博肽(anfibatide,ANF)是從皖南尖吻蝮蛇毒中提取到的一種多肽藥物,由α、β 鏈兩條肽鏈組成,其比活力大于每毫克蛋白1 000個活力單位[14],是首創(chuàng)血小板GPIbα受體拮抗劑。在健康測試人中具有快速起效、有效及可逆的抗血栓作用,不損害凝血功能或延長出血時間。其作用機(jī)制為介導(dǎo)血小板聚集關(guān)鍵成分的GPIb 蛋白,阻斷其與血漿vWF 結(jié)合,阻止血小板粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞壁上,從而抑制血小板聚集[15]。抗血小板治療是心血管病重要的治療方法,由于其治療后仍存在出血或再次血栓的問題,臨床實(shí)驗(yàn)室可以通過檢測血小板功能監(jiān)測患者治療情況。檢測血小板功能有諸多方法,如光學(xué)比濁法、全血電阻法、連續(xù)血小板計數(shù)法等,其原理是通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后血小板數(shù)量的改變來評估血小板功能[16-17]。本研究通過比較以上3種血小板功能檢測方法,優(yōu)選安菲博肽生物活性測定方法,并對該方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1儀器 四通道光學(xué)聚集儀(CHRONO-LOG Corporation,型號:700),血小板聚集儀(CHRONO-LOG Corporation,型號:700),血小板功能分析儀(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司,型號:PL-12),真空采血管(Becton,Dickinson And Company,規(guī)格:0.109 M,3.2%枸櫞酸鈉),微量移液器[艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司,規(guī)格:10 μL,100 μL,1 000 μL];PL-12專用樣品杯(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司)。

1.2試藥 安菲博肽[兆科藥業(yè)(合肥)有限公司,規(guī)格:每支10 U,批號:20180205、20180206、20190601];安菲博肽安慰劑[兆科藥業(yè)(合肥)有限公司,批號:20190603];0.9%氯化鈉溶液(華潤雙鶴利民藥業(yè)有限公司,批號:21011301B);PLR-01血小板稀釋液(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司,批號:22006022)、血小板分析儀專用清洗液(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司,批號:22001151);瑞斯托霉素(American Biochemical &Pharmaceuticals Ltd.,批號:880204)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1誘聚劑的配制 取1支瑞斯托霉素(ristomycin,RIS)凍干粉,加0.9%氯化鈉溶液配制成100 mg·mL-1RIS母液,分裝,-20 ℃冰箱保存;檢測前取出,室溫溶解后混勻,0.9%氯化鈉溶液稀釋至250 mg·mL-1(光學(xué)比濁法、全血電阻法)和7.7 mg·mL-1(連續(xù)血小板計數(shù)法),備用。

2.1.2血樣的制備

2.1.2.1富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)的制備 抽取健康受試者血液,置含有1/10體積枸櫞酸鈉抗凝液(0.109 mol·L-1)的硅化玻璃管中混勻,1 000 r·min-1(r=8.2 cm)離心6 min,收集上清液。

2.1.2.2貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)的制備 將上述剩余血液4 000 r·min-1(r=8.2 cm)離心10 min,取上清液。

2.1.2.3全血取樣 空腹或餐后2 h采用肘靜脈取血法采取健康人血液于真空采血管中備用。本試驗(yàn)已獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審查通過批件。

2.1.3供試品溶液配制 取安菲博肽(每支10 U)3支,每支加入0.9%氯化鈉溶液200 μL溶解,合并,混勻,備用。

2.1.4空白溶液的配制 取0.9%氯化鈉溶液10 μL和全血290 μL,置PL-12專用樣品杯,輕輕混勻樣品,室溫孵育5 min,備用。

2.1.5空白輔料溶液的配制 取安菲博肽安慰劑(批號:20190603)3支,每支加0.9%氯化鈉溶液200 μL溶解,合并、混勻,取稀釋空白輔料溶液10 μL和全血290 μL至PL-12專用樣品杯,輕輕混勻樣品,室溫孵育5 min,備用。

2.2方法步驟

2.2.1光學(xué)比濁法 以PPP 350 μL進(jìn)行透光率調(diào)節(jié)。比濁管中加入PRP 350 μL,37 ℃孵育3 min,加入125 mg·mL-1誘聚劑7.2 μL,記錄對照管血小板聚集百分率。比濁管中加入PRP 350 μL,加入供試品溶液10 μL,37 ℃孵育3 min,加入125 mg·mL-1誘聚劑7.2 μL,記錄樣品管血小板聚集百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=(對照管血小板聚集百分率-樣品管血小板聚集百分率)/對照管血小板聚集百分率×100%。

2.2.2全血電阻法 取全血0.5 mL,加入0.9%氯化鈉溶液0.5 mL,37 ℃孵育3 min,加入電極放入檢測通道,然后加入誘聚劑20 μL(125 mg·mL-1),記錄聚集曲線,測定電阻值,為對照電阻值。取全血0.5 mL,加入0.9%氯化鈉溶液0.5 mL和供試品溶液10 μL,37 ℃孵育3 min,加入電極放入檢測通道,再加入誘聚劑20 μL(125 mg·mL-1),記錄聚集曲線,測定電阻值,為供試品電阻值。血小板聚集抑制百分率(%)=(對照管電阻值-供試品電阻值)/對照管電阻值×100%。

2.2.3連續(xù)血小板計數(shù)法 將含待測供試品溶液(或空白溶液)的PL-12樣品杯,移至PL-12全自動血小板功能分析儀自動檢測。檢測開始后,首先進(jìn)行2次血小板基礎(chǔ)值計數(shù)(最終基礎(chǔ)值為2次平均值),然后自動加入7.7 mg·mL-1RIS誘聚劑30 μL,當(dāng)血小板計數(shù)達(dá)到最低時停止檢測,計算最大聚集率(maximal aggregation ratio,MAR)。MAR(%)=(最終基礎(chǔ)血小板數(shù)-最低血小板數(shù))/最終基礎(chǔ)血小板數(shù)×100%,血小板聚集抑制率(%)=(空白溶液聚集率-供試品溶液聚集率)/空白溶液聚集率×100%。

2.3數(shù)據(jù)分析方法 采用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件分析,多組樣本間差異采用單因素方差(One-way ANOVA)分析方法,對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.4方法篩選 分別以光學(xué)比濁法、全血電阻法和連續(xù)血小板計數(shù)法對3批安菲博肽進(jìn)行活性檢測,結(jié)果見表1—3。3種不同方法檢測3批安菲博肽活性,均差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明3種方法檢測安菲博肽活性結(jié)果呈正相關(guān)。此前,也有通過光學(xué)比濁法與連續(xù)血小板計數(shù)法監(jiān)測血小板聚集功能的比較,證實(shí)連續(xù)血小板計數(shù)法對全血標(biāo)本檢測與光學(xué)比濁法在檢測血小板聚集功能時具有較好相關(guān)性[16-17]。綜上,連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽活性,RSD較小,檢測數(shù)據(jù)較其他2種檢測方法更穩(wěn)定,故采用連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽生物學(xué)活性。

表1 安菲博肽活性檢測結(jié)果(光學(xué)比濁法)

表2 安菲博肽活性檢測結(jié)果(全血電阻法)

表3 安菲博肽活性檢測結(jié)果(連續(xù)血小板計數(shù)法)

2.5方法學(xué)考察

2.5.1專屬性考察 考察空白溶液(0.9%氯化鈉溶液)、空白輔料溶液是否干擾安菲博肽活性檢測結(jié)果,結(jié)果見表4。由表4可知,空白溶液、空白輔料溶液抑制率為0,不干擾安菲博肽活性檢測。

表4 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.2線性范圍考察 配制0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 U供試品溶液(批號:20190601),平行測定,結(jié)果見表5。以供試品活性單位(U)為橫坐標(biāo),抑制率(%)為縱坐標(biāo),擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得Y=1.334X+0.062 4,相關(guān)系數(shù)r為0.994(>0.990)。安菲博肽活性檢測在0.3～0.5 U范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

表5 線性范圍考察結(jié)果

2.5.3精密度考察

2.5.3.1重復(fù)性 分別配制供試品溶液6組(批號:20190601),平行測定,結(jié)果見表6。由表6可知,6組樣品抑制率RSD為11.0%(<20%)。

表6 精密度、重復(fù)性、中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3.2中間精密度 不同時間、不同人員分別配制供試品溶液6組(批號:20190601),平行測定,結(jié)果見表6。結(jié)合重復(fù)性檢測結(jié)果,12組樣品抑制率RSD為9.8%(<20%)。

2.5.4不同人血樣對活性的影響 考察不同人血樣對連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽活性的影響,隨機(jī)采用6份不同人的血樣作為樣本,另取2份處于血小板正常范圍[(100～350)×109·L-1]上限和下限血樣,作為樣本7(85×109·L-1)、樣本8(383×109·L-1);以上述空白溶液、安菲博肽(批號:20190601)于血小板功能分析儀檢測樣品溶液的抑制率。結(jié)果見表7,以6份隨機(jī)不同人血樣檢測得安菲博肽(批號:20190601)抑制率為50.7%、48.1%、43.3%、45.4%、47.4%、43.7%,RSD為6.2%,以樣本7、樣本8血樣檢測得安菲博肽(批號:20190601)的抑制率為45.3%、42.8%,RSD為4.0%,可知不同人血樣不影響連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽的生物活性。

表7 不同人血樣對安菲博肽活性測定的影響

3 討論

光學(xué)比濁法應(yīng)用于血小板功能檢測比較廣泛,甚至被認(rèn)為是血小板功能檢測方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但該法存在操作繁雜、質(zhì)量控制難等問題[18-19]。全血電阻法則通過加入誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)血小板聚集,因電極回路中電阻增加,電流減少,儀器通過檢測電阻的變化來確定血小板聚集率[20]。連續(xù)血小板計數(shù)法是以庫爾特原理為基礎(chǔ)的新型血小板功能檢測方法,通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后全血中血小板數(shù)量的改變來評估血小板功能[16]。通過光學(xué)比濁法、全血電阻法、連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽活性,3種方法檢測安菲博肽活性結(jié)果呈正相關(guān),且連續(xù)血小板計數(shù)法檢測安菲博肽活性RSD較小,檢測數(shù)據(jù)更穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)確定以連續(xù)血小板計數(shù)法、以藥物抑制率為評價指標(biāo)檢測安菲博肽的生物活性。

筆者在本實(shí)驗(yàn)建立了安菲博肽活性測定方法,并通過對方法專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證,該方法操作簡便,專屬性、準(zhǔn)確度和精密度符合生物制品活性測定要求。通過測定3批次安菲博肽活性,3批次結(jié)果一致,說明批次之間質(zhì)量穩(wěn)定和均一。所建立的方法可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制和一致性分析,同時可為其他類型蛋白藥物的質(zhì)量控制提供參考。