孟 穎, 張 倩, 支力強

(1.空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床檢驗科, 陜西 西安 710038 2.陜西省西安市第五醫(yī)院檢驗科, 陜西 西安 710082 3.陜西省西安市紅會醫(yī)院關節(jié)外科, 陜西 西安 710054)

結核病(Tuberculosis,TB)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染使患者管理和結核病控制工作復雜化[1]。在2015年全球發(fā)現(xiàn)的1040萬新結核病病例中,約120萬病例同時感染了HBV病毒,并與較高死亡率(約30%)有關[2]。近年來,國內學者通過開展聯(lián)合TB和HBV雙向篩查提高了抗結核治療的療效,使患者的健康狀況有所改善[2]。值得注意的是,抗藥性結核病的發(fā)病率上升已成為一個主要問題。最近的建模和菌株分型數(shù)據(jù)表明,在缺乏常規(guī)藥物敏感性試驗的情況下,大多數(shù)在復治時診斷的耐多藥(MDR)結核病病例具有原發(fā)(傳播)耐藥性[3]。因此,MDR-TB/HBV在醫(yī)療保健環(huán)境中存在的治療效果不佳以及傳播風險。目前,對于TB/HBV合并感染患者的結核分枝桿菌菌株多樣性、傳播動力學和耐藥性概況的了解仍然有限。本研究檢測了河南省南陽地區(qū)結核分枝桿菌菌株的多樣性,并描述了該地區(qū)TB/HBV合并感染患者對一線抗結核藥物耐藥的頻率和分子機制。

1 資料與方法

1.1菌株來源:研究對來自河南省南陽地區(qū)TB/HBV共感染患者的100株結核分枝桿菌菌株進行了回顧性實驗室分析,其中Beijing譜系株最為普遍(49%),其次是EAI譜系株(35%),少數(shù)菌株包括Haarlem(2.0%)、LAM(1.0%)、MANU(3.0%)、T(4.0%)和U(6.0%)。所有菌株均于2014年至2018年從患者的痰、胸腔積液標本中分離。從實驗室數(shù)據(jù)庫收集人口統(tǒng)計數(shù)據(jù),包括年齡、性別和居住地。

1.2藥敏試驗:原代分枝桿菌培養(yǎng)物生長在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基上。所有被鑒定為結核分枝桿菌的菌株均采用標準比例法[3]對異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇進行了藥物敏感性試驗。培養(yǎng)物在具有以下臨界藥物濃度的固體培養(yǎng)基上生長:異煙肼(0.2μg/mL)、利福平(40μg/mL)、鏈霉素(4μg/mL)和乙胺丁醇(2μg/mL)。

1.3Spoligotyping、MIRU-24分型和基因測序:根據(jù)標準方案進行Spoligotyping研究,并使用國際SIVITWEB數(shù)據(jù)庫(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/)和SPOTCLUST(http://cgi2.cs.rpi.edu/～bennek/SPOTCLUST.html)。根據(jù)Supply的方案(2006)對24個位點穿插重復單元(MIRU-24分型)進行了研究,并使用miru-vntrplus.org在線數(shù)據(jù)庫分配使用MIRU-24分型的菌株譜系。從懸浮于200μL TE緩沖液1X(1mM EDTA,10mM Tris HCl)中的結核分枝桿菌菌落中提取DNA。將提取的DNA儲存在-20℃的冷凍管中用于聚合酶鏈反應(PCR)分析。如前所述進行聚合酶鏈反應,結核分枝桿菌H37RV為陽性對照。對rpoB、katG、inhA和inhA啟動子、rpsL、rrs和embB基因進行了擴增和片段分析。研究分析了6個已知與結核分枝桿菌耐藥性有關的基因片段中的9個:embB基因(1個片段)、rpsL(1個片段)、rrs(2個片段)、rpoB(1個片段)、katG(2個片段)、inhA基因及其啟動子。使用Bioedit Sequence Alignment Editor和Sequence Scanner軟件創(chuàng)建每個片段的共有序列。將片段序列與H37Rv(GenBank NC.000962.3;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)進行比較以評估突變的存在。

2 結 果

2.1患者的一般資料和細菌學特征:TB/HBV合并感染病例中,大多數(shù)(63.2%)是年輕人(25～34歲)(表1)。痰涂片鏡檢結果占93.0%,痰涂片陽性率為38.7%。總的來說,42(42.0%)個分離株對至少一種抗結核藥物具有體外耐藥性;9(9.0%)個分離株為MDR,5(5.0%)個分離株對所有測試的一線藥物具有泛耐藥。對異煙肼的耐藥率為25.0%(25/100),利福平的耐藥率為10.0%(10/100),乙胺丁醇的耐藥率為5.0%(5/100),和鏈霉素的耐藥率為40.0%(40/100)。

表1 患者的一般資料和細菌學特征

2.2TB/HBV合并感染患者分離的耐藥結核分枝桿菌突變:表2顯示了在耐藥結核分枝桿菌分離株中觀察到的所有突變(包括在本研究中相同突變與抗性無關的情況)。在25個異煙肼耐藥性分離株中,分別有100%和21%的katG和inhA(包括inhA啟動子)發(fā)現(xiàn)基因突變。在異煙肼耐藥株中觀察到最常見的katG突變(463 G→T;Arg463Leu)。在inhA基因(Ser94Ala)中僅發(fā)現(xiàn)一個突變,而啟動子inhA區(qū)在-15(14%)和-191(5%)位置具有突變。所有對利福平具有抗性的菌株都有rpoB基因突變;2個分離株具有一個以上的氨基酸取代(Ser531Leu和Thr481Ala;Ser531Leu和Arg529Gln)。60%的利福平耐藥菌株中存在最常見的突變(531 C→T;Ser531Leu)。90%(9/10)具有利福平抗性的分離株在RRDR中具有突變(密碼子507～533)。共有2株利福平耐藥菌株在RRDR外有突變,1株在密碼子572處,1株在密碼子481處。在embB基因中發(fā)現(xiàn)了多個多態(tài)性(表2)。密碼子378(A→C,Glu-Ala)的突變很常見,然而,它被認為是一種系統(tǒng)信息突變,只有1/5(20.0%)具有這種突變的菌株對乙胺丁醇具有抗性(表2)。對rpsL和rrs基因進行測序以探索與鏈霉素抗性相關的突變。rpsL基因的突變存在于24/40(60%)鏈霉素抗性分離株中;主要是密碼子43(47.5%)和88(12.5%)。一個菌株在rpsL(Lys43Arg)和rrs基因的密碼子1401處發(fā)生突變,這與對二線治療的耐藥性相關。rrs基因突變不太常見,存在于6/40(15%)鏈霉素抗性分離株中。在沒有鏈霉素抗性的菌株中未發(fā)現(xiàn)rpsL或rrs基因突變。

表2 從TB/HBV合并感染患者分離的耐藥結核分枝桿菌突變

2.3TB/HBV合并感染患者的結核菌株多樣性和菌株相關耐藥性:表3顯示了觀察到的結核分枝桿菌菌株多樣性和菌株相關的藥物抗性。Beijing譜系株最為普遍(49%),其次是EAI譜系株(35%),少數(shù)菌株包括Haarlem、LAM、MANU、T和U。59.5%存在耐藥性的菌株屬于北京譜系,66.7%的MDR菌株屬于北京譜系。在EIA譜系菌株中,亞系EAI-5占分離株的77.1%(27/35),包括所有MDR菌株。無論是Spoligotyping還是MIRU-24都不能充分區(qū)分北京譜系菌株,但觀察到的可變耐藥譜并不表明存在大的傳播群。

表3 TB/HBV合并感染患者的結核菌株多樣性和菌株相關耐藥性

2.4MDR患者中顯性結核分枝桿菌菌株譜系與耐藥突變之間的關聯(lián):表4反映了在MDR-TB患者中觀察到的耐藥性突變,均發(fā)生在Beijing和EAI譜系菌株。無論菌株背景如何,在大多數(shù)MDR分離株中發(fā)現(xiàn)了兩個突變(rpoB Ser531Leu和katG Ser315Thr)。在9種MDR分離株中,7種(77.8%)在katG基因中具有Ser315Thr取代,1種(11.1%)在inhA基因啟動子中具有-15(C-T)取代。在rpoB基因中,5個(55.6%)MDR分離株具有Ser531Leu和1個MDR分離株在RRDR區(qū)域外(在密碼子572處)具有單個突變。

表4 MDR患者中顯性結核分枝桿菌菌株譜系與耐藥突變之間的關聯(lián)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)鏈霉素耐藥性在TB/HBV合并感染患者中很常見,并且?guī)缀跗毡榇嬖谟谀退幉±小＿@一觀察結果與最近在我國西南地區(qū)的觀察結果相似,其中耐多藥結核病的傳播是由對所有一線藥物具有泛耐藥性的Beijing譜系菌株驅動[4]。在結核病控制計劃中,鏈霉素最近(2016年)被乙胺丁醇取代,成為標準一線治療強化階段的第四種藥物。rpsL基因43和88密碼子突變占鏈霉素耐藥菌株的60%。rrs基因的突變主要在密碼子514和516處,在1400(1401)區(qū)只有一個突變,這與體外對所有二線注射藥物的耐藥性有關[5]。與有關TB感染患者常見的利福平單藥耐藥的報道相反[6],本研究在TB/HBV合并感染中未檢測到利福平的單藥耐藥性,這種差異可能是由HBV共感染引起的。

在異煙肼耐藥菌株中,密碼子463的突變最常見,并且與保留的野生型katG活性有關。在本研究中,大多數(shù)異煙肼耐藥菌株具有Ser315Thr取代,而在inhA基因或其啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)極少數(shù)突變,表明絕大多數(shù)異煙肼耐藥菌株在katG基因中具有突變并且與高水平的異煙肼耐藥性相關。本研究中,未觀察到乙胺丁醇對單一藥物的耐藥性。在乙胺丁醇耐藥菌株中,密碼子378(A→C,Glu-Ala)的突變很常見,然而,它已被認為是具有系統(tǒng)信息的突變,并且只有1/5(20.0%)具有該突變的菌株對乙胺丁醇的抗性[7]。密碼子306在突變中的作用是不確定的,因為它通常在乙胺丁醇耐藥性和易感分離株中檢測到。embB密碼子306、406和497中的突變均與低水平的乙胺丁醇抗性相關。

Beijing系菌株占所有菌株的近一半,并且在MDR菌株中占大多數(shù)。這與非HBV感染患者的先前發(fā)現(xiàn)是一致的[8]。Beijing毒株在大多數(shù)亞洲國家非常流行,在非洲部分地區(qū)的TB/HBV患者中也占主導地位[1]。在EAI譜系中,亞譜系5的比例過高,而亞譜系EAI4-VNM在非HBV感染結核病患者中最為常見。這種差異可能是由HBV共感染引起的,或者表明HBV攜帶者之間可能存在傳播。此外,rpoB基因531密碼子突變和katG基因315密碼子突變與Beijing基因型及多藥耐藥有很強的相關性。本研究包括在本地區(qū)診斷出的有限數(shù)量的TB/HBV共感染患者,這可能并不能代表本地區(qū)所有TB/HBV共感染患者,但它為本地區(qū)TB/HBV合并感染患者的耐藥性突變和結核分枝桿菌菌株多樣性提供了數(shù)據(jù)支持。雖然對新發(fā)和復治結核病病例的結核分枝桿菌分離株進行評估是有意義的,但實驗室數(shù)據(jù)庫中沒有這些信息。

總之,TB/HBV合并感染患者的結核分枝桿菌分離株顯示出較高的耐藥率,其中以Beijing譜系為主。需要更詳細的基因組分析來探索可能影響對二線抗結核藥物耐藥性的傳播模式和突變。