蔡青山, 鄭建興, 申月玲, 吳東洋, 李樹棟, 劉立友, 劉 東

(1.河北省唐山市中心醫(yī)院肝膽外科, 河北 唐山 063000 2.河北省遷安市人民醫(yī)院耳鼻喉科, 河北 遷安 064499)

肝癌是一種常見的癌癥類型,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中受到廣泛關(guān)注[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年全球有超過80萬人因肝癌死亡,占因癌癥死亡人數(shù)的8.3%,僅次于肺癌[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌,約占肝癌病例的 90%[3]。盡管在肝癌的免疫治療等治療方法的研究和臨床應(yīng)用取得了一些進(jìn)展,但HCC患者的預(yù)后仍然不盡人意,復(fù)發(fā)率較高[4]。因此,了解HCC的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的診斷和治療策略來改善HCC患者的整體預(yù)后至關(guān)重要。MicroRNAs(miRNA)是一類長為19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA。根據(jù)完全或部分互補(bǔ)配對(duì),miRNA通過靶向mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)抑制靶向mRNA的表達(dá)[5]。大量研究表明,miRNA在不同的生物過程中起著重要作用,在包括癌癥在內(nèi)的各種疾病中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達(dá)。miR-92a-3p可通過調(diào)節(jié)KLF2/BIRC5軸促進(jìn)乳腺癌的增殖[6]。研究miR-92a-3p在HCC中的作用機(jī)制對(duì)于尋找HCC治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物有重大意義。本研究通過生物信息學(xué)方法分析miR-92a-3p的靶基因,并體外培養(yǎng)人HCC細(xì)胞系,通過細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)研究miR-92a-3p與其靶基因在HCC中的作用,旨在探究miR-92a-3p對(duì)HCC的影響以及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑:人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝細(xì)胞系HL-7702均購自中國北納生物。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自中國Transgen公司;青霉素-鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒、結(jié)晶紫均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT Master Mix、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit均購自日本Takara公司;SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購自德國QIAGEN公司;一抗KLF4(ab215036)、β-actin(ab213262)、二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)均購自英國Abcam公司;ECL試劑盒購自中國碧云天公司;MTT溶液購自中國索萊寶公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;pmirGLO、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝細(xì)胞系HL-7702均用含有10% FBS、100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于含5% CO2的37 ℃孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。pcDNA3.1-KFL4(pcDNA3.1作為對(duì)照)、miR-92a-3p mimic、miR-92a-3p inhibitor以及相應(yīng)的陰性對(duì)照購自加拿大ABM公司。使用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染目標(biāo)質(zhì)粒到SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞系中,分組為Inhibitor NC組、miR-92a-3p Inhibitor組、mimic NC組、miR-92a-3p mimic組、mimic NC+oe-NC組、mimic NC+oe-KLF4組、miR-92a-3p mimic +oe-NC組、miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組。細(xì)胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中,在5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)備用。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Reverse transcription-quantitative PCR,qRT-PCR):為了分析HCC細(xì)胞系中的基因和miRNA表達(dá)水平,使用Trizol試劑和mirVana miRNA分離試劑盒提取了總RNA,并進(jìn)行了qRT-PCR分析。使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄mRNA和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Ki逆轉(zhuǎn)錄miRNA。在ABI 7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中,使用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。miR-92a-3p 以U6為內(nèi)參,KLF4以β-actin為內(nèi)參。所有引物序列見表1,引物均有中國Sangon Biotech公司合成。使用2-ΔΔCt計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB):從HCC細(xì)胞系中提取蛋白質(zhì),并將40μg蛋白質(zhì)通過14.7%聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。在4 ℃下分別與一抗KLF4(1∶1000)和β-actin(1∶10000)進(jìn)行孵育,過夜后用1×TBST溶液在室溫下洗膜5min,沖洗3次。隨后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶2000)在室溫下孵育2h。使用ECL試劑盒在熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶并拍照。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn):細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng),每孔加入0.2mL的細(xì)胞懸液,并重復(fù)操作6次。在培養(yǎng)過程中的第24h、48h、72h、96h和120h,用含有20μL MTT溶液(濃度為5mg/mL)的培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基,并繼續(xù)培養(yǎng)4h。隨后,吸取上清,向每個(gè)孔中加入150μL DMSO以溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的甲烷基藍(lán)晶體。在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值。

1.2.5劃痕愈合實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在6孔板中。當(dāng)細(xì)胞完全附著后,使用移液管頭在每個(gè)孔中劃一條直線。接下來,用PBS洗滌細(xì)胞,并在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h。使用顯微鏡攝像頭拍攝觀察劃痕寬度。

1.2.6Transwell:使用涂有Matrigel基質(zhì)的Transwell小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。在上室中添加無血清重懸的細(xì)胞(2.5×104個(gè)/孔),下室中添加含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。使用棉簽去除留在膜上表面的未侵襲細(xì)胞,將附著在膜下表面的侵襲細(xì)胞在室溫下用10%福爾馬林固定30min,并用0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下任意選擇6個(gè)視野,計(jì)算并拍攝每個(gè)視野中侵襲細(xì)胞的數(shù)量,然后計(jì)算每個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)量的平均值。

1.2.7雙熒光素酶實(shí)驗(yàn):為了驗(yàn)證miR-92a-3p和KLF4之間的靶向結(jié)合關(guān)系,設(shè)計(jì)含有野生型KLF4(KLF4-WT)和突變型KLF4(KLF4-MUT)的pmirGLO熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,質(zhì)粒由中國Sangon Biotech公司合成。使用Lipofectamine 2000試劑將pmirGLO-KLF4-WT/pmirGLO-KLF4-MUT與NC mimic/miR-92a-3p mimic共轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞。按照廠家說明書的要求,使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-92a-3p mimic/NC mimic的SMMC-7721細(xì)胞中的熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-92a-3p在HCC中高表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可限制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲:qRT-PCR檢測(cè)人類正常肝細(xì)胞系HL-7702和人類HCC細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中miR-92a-3p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,HCC細(xì)胞系中miR-92a-3p的表達(dá)水平高于HL-7702細(xì)胞(P<0.05,圖1A)。選擇miR-92a-3p表達(dá)相對(duì)較高的HCC細(xì)胞系SMMC-7721和Bel-7402進(jìn)行敲低miR-92a-3p處理,進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR結(jié)果表明,miR-92a-3p Inhibitor組中miR-92a-3p的表達(dá)水平顯著低于Inhibitor NC組(P<0.05,圖1B)。MTT結(jié)果表明,miR-92a-3p抑制后HCC細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05,圖1C)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-92a-3p Inhibitor組的細(xì)胞侵襲能力相比Inhibitor NC組顯著降低(P<0.05,圖1D)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-92a-3p Inhibitor組的細(xì)胞遷移能力相比Inhibitor NC組顯著降低(P<0.05,圖1E)。

圖1 低表達(dá)miR-92a-3p抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移

2.2KLF4可能受miR-92a-3p靶向,在HCC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào):從GEO數(shù)據(jù)庫獲取HCC表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE49515并進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)共有589個(gè)顯著差異表達(dá)基因(DEGs),其中249個(gè)基因在HCC中表達(dá)顯著下調(diào)。接著,我們利用miRDB等數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了miR-92a-3p的下游靶基因,取預(yù)測(cè)結(jié)果與GSE49515數(shù)據(jù)集中的下調(diào)DEGs交集得到了5個(gè)可能的靶基因(圖2A)。表達(dá)分析顯示,這五個(gè)基因在HCC中均明顯低表達(dá)(圖2B),其中KLF4基因在HCC中的表達(dá)變化最大(表2)。因此,我們選擇KLF4作為研究對(duì)象進(jìn)行分析。qRT-PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞系HL-7702和四個(gè)HCC細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中的KLF4 mRNA表達(dá),并發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞系中的KLF4 mRNA表達(dá)顯著低于HL-7702(P<0.05,圖2C)。因此KLF4可能是miR-92a-3p的調(diào)控靶點(diǎn),并且在HCC細(xì)胞中低表達(dá)。

圖2 KLF4可能是miR-92a-3p的靶點(diǎn),在HCC中低表達(dá)

表2 候選目標(biāo)基因的差異性表達(dá)

2.3MiR-92a-3p靶向KLF4:TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,KLF4 mRNA的3'UTR與miR-92a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-92a-3p與KLF4的結(jié)合情況。結(jié)果表明,相比于mimic NC組,miR-92a-3p mimic組WT KLF4 mRNA 3'UTR的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而MUT KLF4 mRNA 3'UTR的熒光素酶活性沒有顯著差異(P>0.05,圖3B)。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)mimic NC組和miR-92-3p mimic組KLF4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明, miR-92a-3p mimic組顯SMMC-7721細(xì)胞中的KLF4表達(dá)顯著降低(P<0.05,圖3C-D)。

圖3 MiR-92a-3p 靶向KLF4

2.4MiR-92a-3p靶向KLF4刺激HCC細(xì)胞的發(fā)展:qRT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組的KLF4 mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-92a-3p上調(diào)時(shí),KLF4 mRNA水平顯著下降(P<0.05)。同時(shí),過表達(dá)KLF4可以減弱miR-92a-3p過表達(dá)對(duì)KLF4 mRNA表達(dá)的抑制作用(P<0.05,圖 4A)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組KLF4的蛋白表達(dá)顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-NC組KLF4的蛋白表達(dá)顯著降低,而miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4蛋白表達(dá)水平顯著高于miR-92a-3p mimic +oe-NC組(圖4B)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組細(xì)胞增殖能力顯著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC組細(xì)胞的增殖能力顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4增殖能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC組顯著降低(P<0.05,圖4C)。Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)表明,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-KLF4組細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC組細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4組KLF4遷移、侵襲能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC組顯著降低(P<0.05,圖4D-E)。

圖4 MiR-92a-3p通過抑制KLF4的表達(dá)促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明,miRNA的異常表達(dá)與各種癌癥相關(guān)。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨髓微環(huán)境中的miR-126可以控制慢性髓細(xì)胞白血病的白血病干細(xì)胞的自我更新[7]。miR-92a-3p是一個(gè)重要的miRNA,目前有關(guān)miR-92a-3p的報(bào)道顯示它可以加速細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Zhang等[8]報(bào)道,受lncRNA MT1JP的影響,miR-92a-3p調(diào)控FBXW7,從而影響胃癌的惡性發(fā)展。Yu等[6]證明,miR-92a-3p可以通過調(diào)節(jié)KLF2/BIRC5軸促進(jìn)乳腺癌增殖。本研究首先通過qRT-PCR測(cè)得miR-92a-3p在HCC中顯著高表達(dá)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)也顯示敲低miR-92a-3p對(duì)HCC的增殖、遷移、侵襲起到了抑制作用。結(jié)果表明抑制miR-92a-3p可以抑制HCC細(xì)胞的進(jìn)展,miR-92a-3p在肝細(xì)胞癌中可作為促癌因子,這與前人研究的結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道,miRNA可以通過調(diào)節(jié)靶基因發(fā)揮其生物學(xué)功能[9]。在HCC中,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)KLF4可能是miR-92a-3p的靶基因。KLF4是一種包含鋅指的進(jìn)化保守性轉(zhuǎn)錄因子,它在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮作用,如細(xì)胞生長、增殖和分化。目前,KLF4已被廣泛研究,研究發(fā)現(xiàn)它可以調(diào)節(jié)胃癌的進(jìn)展[10]。此外,Xu等[11]發(fā)現(xiàn)KLF4在非小細(xì)胞肺癌中起抑癌作用,且受miR-3120-5p靶向調(diào)節(jié)。本研究通過TargetScan預(yù)測(cè)了miR-92a-3p與KLF4存在靶向結(jié)合位點(diǎn),并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。隨后進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究過表達(dá)miR-92a-3p和過表達(dá)KLF4對(duì)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)KLF4可抑制HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,而過表達(dá)miR-92a-3p可以減弱過表達(dá)KLF4對(duì)HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用,表明miR-92a-3p對(duì)癌細(xì)胞的影響在一定程度上會(huì)削弱KLF4的作用。這說明miR-92a-3p可以通過抑制KLF4的表達(dá)來促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p在HCC細(xì)胞中高表達(dá),并且可能是一個(gè)有用的預(yù)后生物標(biāo)志物。miR-92a-3p可以通過抑制KLF4促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-92a-3p/KLF4軸可能是HCC的一個(gè)潛在新治療靶點(diǎn),希望該研究能為HCC的治療提供新思路。