李 恒, 張翠蘭

(海南西部中心醫(yī)院內(nèi)分泌科, 海南 儋州 571700)

胰島β細胞是主要的胰島細胞,其主要功能是合成并分泌胰島素,調(diào)節(jié)機體血糖水平。胰島β細胞損傷后功能障礙和胰島素抵抗是2型糖尿病的主要致病因素[1]。處于高糖高脂(high glucose and high fat,HGHF)環(huán)境下的胰島β細胞不僅會發(fā)生死亡,還會影響胰島素分泌水平,導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[2]。因此,減少或抑制HGHF環(huán)境下胰島β細胞損傷能夠延緩糖尿病的發(fā)生,這也是有效控制病情持續(xù)性惡化而引起多種發(fā)病癥的關(guān)鍵步驟。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)是一種廣譜存在的花青素類型,屬于類黃酮組多酚,主要源于黑色、紫色或紅色蔬菜水果中。C3G具有抗炎、抗氧化作用,對于多種疾病如癌癥、心血管疾病、腸道疾病和神經(jīng)退行性疾病的防治中均能夠產(chǎn)生積極效應(yīng)[3]。研究表明,較高的膳食花青素攝入量與較低的糖尿病發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[4],此外,C3G能夠減輕胰島蛋白和β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide 1-42,Aβ1-42)刺激下的胰島β細胞損傷[5]。然而,C3G抗糖尿病作用的潛在分子機制尚未明確。鑒于此,本研究采用葡萄糖與棕櫚酸建立體外HGHF環(huán)境,觀察C3G對HGHF環(huán)境下胰島β細胞糖脂毒性的抵抗效果并探究其作用機制,以期為糖尿病新治療方案的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑:MIN6小鼠胰島β細胞購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司,胎牛血清購于南京森貝伽生物科技有限公司,RPMI-1640 培養(yǎng)液和胰蛋白酶購于美國ScienCell公司,葡萄糖、棕櫚酸及3-MA購于美國Sigma公司,C3G和DCFH-DA活性氧熒光探針購于北京康瑞納生物科技有限公司,CCK-8檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司,MDA比色法測試盒、SOD比色法測試盒及GSH比色法測試盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,胰島素ELISA檢測試劑盒購于上海遠慕生物科技有限公司,Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司,通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司,蛋白裂解液購于上海雅吉生物科技有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司,PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光液購于上海碧云天生物研究所,LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記抗體購于英國Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng):胰島β細胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi),待細胞生長至融合度達到80%以上時,采用0.25%胰蛋白酶消化,進行常規(guī)傳代。

1.2.2CCK-8法:將胰島β細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中,過夜培養(yǎng)后,換用含10、20、30、40、50μmoL/L C3G的培養(yǎng)液處理24h,以未經(jīng)處理的胰島β細胞作為對照組,采用CCK-8法檢測各處理組細胞活力,按照試劑盒說明書步驟操作,多功能酶標儀測定各孔在490 nm 處的吸光度(OD),計算細胞活力,細胞活力(%)=[(OD處理組-OD空白組)/(OD正常組-OD空白組)]×100%。再將胰島β細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸的培養(yǎng)液建立高糖高脂環(huán)境,同時添加10、20、30、40、50μmoL/L C3G處理,同樣以未經(jīng)處理的胰島β細胞作為對照組,單獨25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸處理的胰島β細胞作為HGHF組,24h后收集細胞,按照CCK-8法檢測各處理組細胞活力。

1.2.3分組與處理:將胰島β細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中,在37℃、5%CO2恒溫箱過夜培養(yǎng)至細胞貼壁后,分為4組:①對照組,胰島β細胞在普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h;②HGHF組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸的培養(yǎng)液建立HGHF模型,培養(yǎng)細胞24h;③HGHF+C3G組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸、40μmoL/L C3G的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24h[6];④HGHF+C3G+3-MA組,使用含25mmoL/L葡萄糖與0.5mmoL/L棕櫚酸、40μmoL/L C3G的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24h,同時添加10mmoL/L自噬抑制劑3-MA處理細胞,3-MA給藥劑量參考文獻中的劑量[7]。結(jié)束后,收集以上4組細胞,CCK-8法檢測各處理組細胞活力。

1.2.4氧化應(yīng)激指標檢測:將胰島β細胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中,按1.2.3分組處理后,添加1μmoL/L DCFH-DA熒光探針,37℃孵育30min,PBS洗滌,采集熒光圖像,Image J分析熒光強度。并收集各處理組細胞,棄上清,加入裂解液提取總蛋白,分別按照MDA、SOD、GSH的檢測試劑盒說明書,對細胞總蛋白中各指標進行測定。

1.2.5ELISA法:收集各處理組胰島β細胞,棄上清后,PBS洗滌,分別添加含2.8mmoL/L和16.7mmoL/L葡萄糖的KRBH緩沖液,37℃孵育1h,1000r/min離心20min,收集上清,按照胰島素ELISA試劑盒說明書測定上清液中胰島素分泌量。

1.2.6實時熒光定量PCR:采用Trizol法提取各處理組胰島β細胞的總RNA,檢測RNA純度與濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA,使用熒光定量試劑盒進行擴增,按照說明書配置25μL反應(yīng)體系,設(shè)置條件為95℃、30s;95℃、5s,60℃、30s,40cycles,在CFX96儀上進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,獲得擴增曲線與溶解曲線,通過2-△△Ct法分析各個待測樣本內(nèi)目的基因的mRNA相對表達量,以GAPDH作為內(nèi)參。引物見表1。

表1 基因引物序列

1.2.7Western blot:在各處理組胰島β細胞中加入裂解液充分裂解細胞,離心后收集上清,BCA法定量。根據(jù)蛋白濃度在上樣孔中加入等量蛋白,通過10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂奶粉封閉 2h,TBST 洗滌,分別加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3抗體(1∶1000),4 ℃搖床孵育過夜,次日,TBST洗膜,加入對應(yīng)二抗(1∶5000)繼續(xù)孵育2h,采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,凝膠成像儀采集蛋白條帶,ImageJ分析灰度值,以 GAPDH 作為內(nèi)參,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1C3G對高糖高脂環(huán)境下胰島β細胞活力的影響:與對照組比較,10、20、30、40、50μmoL/L C3G處理對胰島β細胞活力均具有顯著的促進作用(P<0.05),但各濃度之間的活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖1A。HGHF組胰島β細胞活力顯著低于對照組(P<0.05),而與HGHF組比較,在高糖高脂環(huán)境下,20、30、40、50μmoL/L C3G能夠顯著提高胰島β細胞活力(P<0.05),且隨著C3G濃度升高,細胞活力越高(P<0.05),但40、50μmoL/L C3G處理下細胞活力之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖1B,因此后續(xù)選擇40μmoL/L作為C3G的處理濃度。

圖1 各處理組胰島β細胞活力

加入自噬抑制劑3-MA抑制自噬水平后,對4組胰島β細胞活力進行檢測比較發(fā)現(xiàn),與對照組比較,HGHF組細胞活力顯著降低(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞活力顯著升高(P<0.05);而與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞活力則顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各處理組胰島β細胞活力

2.2C3G對高糖高脂環(huán)境下胰島β細胞氧化應(yīng)激的影響:利用DCFH-DA熒光探針法檢測各組胰島β細胞內(nèi)ROS含量,以綠色熒光評價ROS水平。與對照組比較,HGHF組細胞熒光強度顯著升高(P<0.05),表明ROS含量增加;與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞熒光強度顯著降低(P<0.05),表明ROS含量減少;與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞熒光強度顯著降低(P<0.05),表明ROS含量增加。此外,對各組胰島β細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH進行檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,HGHF組細胞中MDA含量顯著上升(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著下降(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中MDA含量顯著下降(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著上升(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中MDA含量顯著上升(P<0.05),SOD活性和GSH-Px含量顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各處理組胰島β細胞中各氧化應(yīng)激指標比較

2.3C3G對高糖高脂環(huán)境下胰島β細胞胰島素分泌水平的影響:分別以2.8mmoL/L和16.7mmoL/L濃度的葡萄糖刺激各組胰島β細胞后對胰島素分泌水平進行檢測,結(jié)果顯示,HGHF組胰島素分泌水平顯著低于對照組(P<0.05);HGHF+C3G組胰島素分泌水平顯著高于HGHF組(P<0.05);但與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組胰島素分泌水平又顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各處理組胰島β細胞分泌胰島素水平比較

2.4C3G對高糖高脂環(huán)境下胰島β細胞中自噬信號相關(guān)蛋白表達的影響:qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,HGHF組胰島β細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

圖3 各處理組胰島β細胞中Atg5、LC3、Beclin-1的mRNA表達水平

Western blot 檢測結(jié)果顯示,HGHF組胰島β細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量顯著低于對照組(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量則顯著上調(diào)(P<0.05);但HGHF+C3G+3-MA組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達量又顯著低于HGHF+C3G組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各處理組胰島β細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達水平

2.5C3G對高糖高脂環(huán)境下胰島β細胞凋亡信號相關(guān)蛋白表達的影響:Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,HGHF組胰島β細胞中Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05);與HGHF組比較,HGHF+C3G組細胞中Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著下調(diào)且Bcl-2蛋白相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05);與HGHF+C3G組比較,HGHF+C3G+3-MA組細胞中Bax和Cleaved Caspase-3的蛋白相對表達量顯著上調(diào)、Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖5。

圖5 各處理組胰島β細胞中Bax、Bcl-2及Cleaved Caspase-3蛋白表達水平

3 討 論

2型糖尿病是一種進展緩慢的全身性疾病,病因尚不明確。慢性高脂血癥和高血糖是2型糖尿病的典型特征,反復(fù)或持續(xù)暴露于高葡萄糖和高脂質(zhì)如飽和脂肪酸環(huán)境中時,會導(dǎo)致胰島β細胞損傷,并損害胰島β細胞分泌胰島素的功能。近年來,關(guān)于C3G在糖尿病及其并發(fā)癥中的研究報道不斷增加。例如,C3G可以直接促進一氧化碳介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)運胰島素水平,從而改善胰島素抵抗[8];C3G抑制高血糖環(huán)境誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的遷移與侵襲,并減少糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠的視網(wǎng)膜血管滲漏和血管生成[9];C3G能改善糖尿病腎病小鼠的腎功能以及腎組織損傷[10]。由此可見,C3G在糖尿病的治療中具有較高的潛在價值。本研究使用不同濃度C3G處理胰島β細胞后,結(jié)果顯示,胰島β細胞活力升高,提示C3G對胰島β細胞活力具有促進作用;此外,在HGHF環(huán)境下加入C3G進行干預(yù),能提高胰島β細胞活力,增加胰島素分泌水平。以上結(jié)果表明,C3G對HGHF環(huán)境下的胰島β細胞具有保護作用。

糖毒性和脂毒性可誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),這與胰島β細胞功能障礙和細胞凋亡的發(fā)生機制有關(guān)。長時間的高糖超負荷會增加細胞中ROS的產(chǎn)生,導(dǎo)致新陳代謝紊亂和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑異常。高濃度的游離脂肪酸也會誘導(dǎo)ROS生成,進而影響胰島β細胞的活性和功能[11]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物,其反映了細胞的脂質(zhì)過氧化速率或強度,在高糖環(huán)境下MDA含量的高低能間接體現(xiàn)胰島β細胞的損傷程度,即濃度越高表示細胞受損程度越大。SOD作為一種關(guān)鍵的細胞內(nèi)抗氧化劑,可去除細胞內(nèi)超氧陰離子自由基,GSH-Px則作為清除劑,通過減少過氧化氫和脂質(zhì)氫過氧化物來保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性,這兩種指標升高也能反映胰島β細胞受損[12]。本研究結(jié)果顯示,HGHF環(huán)境下培養(yǎng)的胰島β細胞中ROS含量和MDA含量上升,SOD活性和GSH-Px含量下降;而在HGHF環(huán)境下加入C3G干預(yù)的胰島β細胞中ROS含量和MDA含量下降,SOD活性和GSH-Px含量上升,說明C3G能夠抑制HGHF環(huán)境下胰島β細胞內(nèi)過度的氧化應(yīng)激,改善細胞損傷。

自噬是一種溶酶體降解途徑,通過降解受損蛋白質(zhì)和細胞器來維持細胞代謝穩(wěn)態(tài)。胰島β細胞功能與自噬有著千絲萬縷的聯(lián)系。在HGHF環(huán)境下自噬通量被阻斷,胰島β細胞受損,胰島素分泌異常[13]。以往有研究表明,C3G會增加細胞進行選擇性自噬的能力,在不利因素下允許細胞靶向特定底物進行降解,以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14]。本實驗結(jié)果顯示,在HGHF環(huán)境下加入C3G干預(yù)的胰島β細胞中,Atg5、LC3、Beclin-1 mRNA表達上調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達上調(diào),促凋亡因子Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達下調(diào)而抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達上調(diào)。由此推測,C3G對HGHF環(huán)境下胰島β細胞的保護作用可能與其誘導(dǎo)自噬有關(guān)。為了驗證此推測,加入自噬抑制劑3-MA作用后,C3G對HGHF環(huán)境下胰島β細胞損傷的改善效應(yīng)消失,該結(jié)果進一步明確了C3G對HGHF環(huán)境下胰島β細胞的保護作用與促進自噬有關(guān)。

綜上所述,本研究表明C3G對HGHF環(huán)境下胰島β細胞具有保護作用,C3G改善能HGHF刺激下的胰島β細胞活性和胰島素分泌水平,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),下調(diào)促凋亡因子Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達,上調(diào)抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達,該作用機制可能與其促進HGHF環(huán)境下胰島β細胞的自噬水平有關(guān)。本研究進一步揭示了C3G作為抗糖尿病藥物的潛力,為新藥物開發(fā)提供了參考依據(jù)。