唐方媛, 張婭娣, 劉 詠, 王軍輝,3

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 3.合肥工業(yè)大學(xué) 安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230601)

0 引 言

食用菌指子實(shí)體碩大、可供食用的大型真菌[1],因獨(dú)特的風(fēng)味、營養(yǎng)及保健功能受到研究人員的廣泛關(guān)注。多糖是真菌發(fā)揮生理活性的重要活性物質(zhì)[2],是細(xì)胞壁的組成、能量儲備的細(xì)胞內(nèi)包涵體和細(xì)胞外用于保護(hù)細(xì)胞的附著物[3],在增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面具有顯著的藥理學(xué)功效[4-7]。多糖作為天然免疫調(diào)節(jié)劑,通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)和免疫細(xì)胞,促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放從而誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)活性[8],成為功能食品和藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體免疫的一種重要效應(yīng)細(xì)胞,在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中可發(fā)揮吞噬、呈遞抗原和分泌細(xì)胞因子等作用[9]。

白玉菇又名白玉蕈(whiteHypsizygusmarmoreus),屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬,是真姬菇的一種穩(wěn)定白色變異體菌株[10]。其色澤剔透,口感優(yōu)越,深受消費(fèi)者青睞。白玉菇富含多種維生素和礦物質(zhì),多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)7.50%,高于其他食藥用菌(如香菇、猴頭菇、竹蓀、金耳、豬苓等),是一種高蛋白、低脂肪的功能性食品[11]。研究表明,具有較好生物活性的真菌提取物大多來自擔(dān)子菌綱和子囊菌綱[12]。因此,對白玉菇多糖進(jìn)行生物活性的研究具有重要意義。

本文對白玉菇子實(shí)體多糖進(jìn)行多層次提取,在分離純化的基礎(chǔ)上通過藥理學(xué)模型,研究白玉菇多糖對巨噬細(xì)胞增殖、吞噬能力和NO釋放量的影響,評價(jià)其對機(jī)體的免疫活性,篩選出較優(yōu)的活性組分,為深入研究白玉菇多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及開發(fā)多糖資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白玉菇子實(shí)體購于安徽省合肥市某大型市場;無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸、硼氫化鈉、氯仿等均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DEAE-Cellulose購于索萊寶科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、脂多糖、胎牛血清購于Hyclone公司;NO檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);氣相色譜儀(Agilent公司);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會社)。

1.3 白玉菇多糖的提取

新鮮白玉菇子實(shí)體經(jīng)冷凍干燥后,使用高速藥品粉碎機(jī)粉碎,過200目篩后置于索氏提取器中在90 ℃無水乙醇脫色脫脂24 h,烘干備用。

白玉菇粉末以1∶20的料液比在0.9%氯化鈉溶液常溫提取12 h,重復(fù)提取3次。提取液離心去除不溶物,上清液濃縮后用Sevag試劑脫蛋白,重復(fù)數(shù)次后取分液漏斗上層溶液減壓蒸餾,除去有機(jī)溶液。濃縮液用30% H2O2脫色后于流水和去離子水中分別透析3 d,透析液凍融離心后冷凍干燥得到白玉菇常溫水提多糖(WHN)。

常溫提取殘?jiān)?∶20的料液比在0.9%氯化鈉溶液100 ℃提取2 h,離心除去不溶物,重復(fù)提取2次。上清液經(jīng)濃縮、脫蛋白、脫色、透析和凍融后冷凍干燥得到白玉菇沸水浸提多糖(WHB)。

稱取120 mg白玉菇多糖溶解于10 mL去離子水中,離心后用移液管將上清液緩慢滴加到預(yù)裝完成的DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱(3.0 cm×40 cm)中,依次用不同濃度的氯化鈉溶液(0、0.1、0.2 mol/L)逐步洗脫,流速2 mL/min。自動收集洗脫液(10 mL/管),并通過苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。收集多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的峰,凍干得到純化多糖。

1.4 白玉菇多糖的理化性質(zhì)測定

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用苯酚-硫酸法[13]測定其在490 nm處的吸光度,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定其在595 nm處的吸光度,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用間羥基聯(lián)苯法[15]測定其在520 nm處的吸光度,以半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改進(jìn)行單糖組成分析。取5 mg待測樣品置于安瓿管中,加入三氟乙酸110 ℃水解4 h后,減壓蒸干。將完全水解后的樣品在NaBH4水溶液中還原3 h,25%的醋酸溶液中和后減壓蒸干,于115 ℃烘箱中干燥20 min。加入等體積的乙酸酐和吡啶,在密封條件下100 ℃反應(yīng)1 h。減壓蒸干至有粉末物質(zhì)出現(xiàn),加入適量的氯仿和去離子水,萃取至水層澄清。用無水硫酸鈉除去有機(jī)相中水分,過有機(jī)濾膜(孔徑為0.22 μm)后將樣品溶液裝入瓶中于氣相色譜儀中進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間判定多糖中的單糖成分,以峰面積計(jì)算單糖的摩爾分?jǐn)?shù)。

1.5 多糖的免疫活性研究

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中,37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。

采用MTT法測定白玉菇多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖活性的影響。用DMEM培養(yǎng)液將對數(shù)生長期細(xì)胞密度稀釋至1.0×105個(gè)/mL,等量接種150 μL于96孔板中,孵育24 h。加入50 μL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液(終質(zhì)量濃度為0、50、100、200、500 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除孔板中的液體,快速加入200 μL DMSO,室溫振蕩10 min,使用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度?？瞻讓φ战M為DMEM培養(yǎng)基,陽性對照組為脂多糖LPS。增值指數(shù)計(jì)算公式如下:

增值指數(shù)=A1/A0,

其中:A1為樣品在570 nm處的吸光度;A0為空白對照在570 nm處的吸光度。

通過NO檢測試劑盒測定白玉菇多糖對 LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO產(chǎn)生的影響。按照上述方法培養(yǎng)48 h后,吸取100 μL培養(yǎng)液于新板中,加入Griess試劑,靜置10 min;酶標(biāo)儀540 nm處測定吸光度?？瞻讓φ战M為DMEM培養(yǎng)基,陽性對照組為LPS。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品NaNO2繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO釋放量。

按照上述方法培養(yǎng)48 h后移除培養(yǎng)液,PBS清洗2次,加入100 μL中性紅溶液,培養(yǎng)4 h后移除多余溶液;PBS清洗2次,加入細(xì)胞裂解液,室溫放置1 h;酶標(biāo)儀540 nm下測量吸光度。空白對照組為DMEM培養(yǎng)基,陽性對照組為LPS。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差)形式表示。采用Origin 8.0軟件繪制圖表,利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,使用t檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。*表示P<0.05差異顯著,**表示P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 白玉菇多糖的分離純化

白玉菇子實(shí)體粉末經(jīng)脫色脫脂后,常溫提取液濃縮、脫蛋白、脫色、透析后得到多糖WHN。常溫提取殘?jiān)?jīng)沸水浸提、離心、濃縮、脫蛋白、脫色、透析后得到多糖WHB。WHN和WHB分別通過DEAE-Cellulose 離子交換層析柱進(jìn)行分離純化,如圖1所示。經(jīng)0、0.1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫后共獲得6個(gè)洗脫片段,濃縮、透析和冷凍干燥后,分別命名為WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3。

圖1 DEAE-Cellulose離子交換層析柱洗脫曲線

2.2 白玉菇多糖化學(xué)組成分析

各組分的單糖組成及其成分分析結(jié)果見表1所列。從表1可以看出,WHN和WHB的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為67.72%、80.54%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為28.65%、15.63%,糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.13%、0.41%。隨著提取溫度的增加,更有益于多糖的溶出。2種粗多糖經(jīng)分離純化后得到6種組分,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.48%～98.77%,同時(shí)蛋白質(zhì)、糖醛酸得到有效洗脫,質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小。

表1 白玉菇粗多糖和分級組分的理化性質(zhì)分析 %

單糖組成分析結(jié)果顯示2種粗多糖均為含有6種單糖的雜多糖。WHN中半乳糖的摩爾分?jǐn)?shù)最大,達(dá)到49.8%。WHB的單糖組成以葡萄糖為主,摩爾分?jǐn)?shù)為79.8%。組分間差異可能是由于WHN是在溫和條件下提取到的胞外多糖,WHB為劇烈條件下提取到的不同部位多糖。常溫水提多糖WHN的半乳糖隨著DEAE-Cellulose 離子交換層析柱的洗脫逐漸減少,WHN1、WHN2、WHN3中半乳糖的摩爾分?jǐn)?shù)分別為39.4%、35.6%、26.5%,同時(shí)各組分間葡萄糖的摩爾分?jǐn)?shù)增加到34.3%、25.8%、25.4%。WHB的各分級組分的單糖組成以葡萄糖為主,摩爾分?jǐn)?shù)分別為78.5%、90.8%、100.0%。結(jié)果顯示W(wǎng)HB3為葡聚糖,WHB1和WHB2為含有葡萄糖和少量的甘露糖、半乳糖或阿拉伯糖的雜多糖。比較8種多糖組分發(fā)現(xiàn),單糖組成差異可能與提取溫度及純化方法有關(guān)。

2.3 白玉菇多糖的免疫活性分析

多糖WHN及其3種分級組分對多巨噬細(xì)胞增殖活性的影響如圖2a所示。從圖2a可以看出:在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與空白對照組相比,WHN及其3種分級組分對RAW264.7細(xì)胞均無毒性,表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖且增殖指數(shù)隨多糖質(zhì)量濃度的增大呈劑量依賴性減小;WHN1、WHN2、WHN3在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)極顯著地提高了細(xì)胞增殖指數(shù)(P<0.01),20 μg/mL處理時(shí)增殖指數(shù)最大,分別達(dá)到1.48、1.25、1.27,3種分離組分對細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用均高于WHN,其中WHN1最優(yōu)。

圖2 白玉菇多糖對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

WHB及其3種分級組分對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響如圖2b所示。從圖2b可以看出,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與空白對照組相比,4種組分對RAW264.7無細(xì)胞毒性,均顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)。其中,WHB在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)增殖指數(shù)達(dá)到最大值1.50。WHB1處理的細(xì)胞增殖活性隨著多糖質(zhì)量濃度的增大呈劑量依賴性減小,20 μg/mL處理時(shí)增殖指數(shù)最大為1.32。50 μg/mL WHB2和WHB3處理時(shí)細(xì)胞增殖指數(shù)最大,分別為1.37和1.53,其中WHB3在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最佳的增殖活性。比較8種多糖片段,多糖對細(xì)胞增殖活性的影響可能與葡萄糖的摩爾分?jǐn)?shù)有關(guān)。

研究表明,巨噬細(xì)胞的吞噬作用在免疫反應(yīng)中起重要作用,是免疫反應(yīng)中的第1個(gè)關(guān)鍵步驟[16]。8種多糖組分對RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響如圖3所示。從圖3a可以看出,WHN及其分級組分均在不同程度上刺激提升了巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬能力。在多糖質(zhì)量濃度為20～50 μg/mL,與空白對照相比,WHN和WHN3極顯著地促進(jìn)細(xì)胞吞噬作用(P<0.01)。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),WHN1促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬的活性隨著質(zhì)量濃度的增加而減小,20 μg/mL時(shí),吞噬能力最佳,與空白對照組相比,差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,WHN1在各質(zhì)量濃度下促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬作用的活性優(yōu)于其他2種組分。

圖3 白玉菇多糖對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

從圖3b可以看出,隨著多糖WHB質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng),在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬活性顯著提高(P<0.01),質(zhì)量濃度超過200 μg/mL后,吞噬活性隨之減小。WHB1對吞噬作用的促進(jìn)作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加先增大后減小,在50 μg/mL時(shí),吞噬活性達(dá)到最大,差異極顯著(P<0.01);WHB2對巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的促進(jìn)作用與WHB有相似的趨勢,在多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),細(xì)胞吞噬能力最佳,與空白對照組相比,顯示出極顯著差異(P<0.01)。WHB3對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加顯示出劑量依賴性減弱,20 μg/mL時(shí),吞噬活性達(dá)到最大2.40,與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。在實(shí)驗(yàn)范圍的各質(zhì)量濃度下,WHB3的吞噬活性優(yōu)于其他組分。

NO是巨噬細(xì)胞攻擊異物時(shí)釋放的主要活性氧(reactive oxide species,ROS)之一[17]。8種組分對巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響如圖4所示。從圖4a可以看出,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)組與空白對照組相比均表現(xiàn)為促進(jìn)NO產(chǎn)生。其中水提組分WHN、WHN2、WHN3對NO釋放量的影響隨著多糖質(zhì)量濃度的增大呈劑量依賴性增大,質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)NO釋放量達(dá)到最大值,分別為2.89、4.12、2.16 μmol/L。WHN1刺激RAW264.7細(xì)胞釋放的NO釋放量呈先增大后降低的趨勢,在200 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值4.64 μmol/L,促進(jìn)NO產(chǎn)生效果優(yōu)于其他組分。

圖4 白玉菇多糖對巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響

熱水提組分WHB、WHB1、WHB2刺激RAW264.7細(xì)胞NO釋放的效果與多糖質(zhì)量濃度成正比。在各實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下,WHB3刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO與空白對照組相比均差異極顯著(P<0.01),與多糖WHB1和WHB2相比,WHN3顯示出最佳的刺激活性,在500 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值4.11 μmol/L。

3 結(jié) 論

本文對白玉菇常溫水提多糖WHN和沸水浸提多糖WHB分離純化出6種分級組分WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3,并對這8種組分進(jìn)行理化性質(zhì)和免疫活性的篩選。6種分級組分總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.48%～98.77%,高于粗多糖,且蛋白質(zhì)和糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。受提取溫度影響,單糖組成結(jié)果顯示8種組分的單糖摩爾分?jǐn)?shù)均不相同,其中WHN及其分級組分是以半乳糖和葡萄糖為主的雜多糖,WHB、WHB1、WHB2是以葡萄糖為主的雜多糖,WHB3為葡聚糖。體外免疫實(shí)驗(yàn)中,各組分對RAW264.7均無細(xì)胞毒性,表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖和吞噬,其中WHN1和WHB3處理的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)活性。WHN1在200 μg/L時(shí)NO釋放量為4.64 μmol/L,500 μg/L WHN3處理時(shí)NO釋放量為4.11 μmol/L,較好的免疫活性可能與高摩爾分?jǐn)?shù)的葡萄糖有關(guān)。

研究結(jié)果從理化性質(zhì)和免疫活性2個(gè)方面篩選出2種活性較好的白玉菇多糖,為其在藥物和功能性食品的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。文獻(xiàn)[1]指出,具有1,3-β-Glc和1,6-β-Glc連接方式的香菇多糖和平菇多糖,通過促進(jìn)細(xì)胞吞噬及上調(diào)NO釋放來發(fā)揮較好的免疫調(diào)節(jié)活性,白玉菇多糖結(jié)構(gòu)對免疫發(fā)生機(jī)制與信號通路調(diào)控的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。