李亞凱, 周存六, 李 銳, 潘冬梅, 周 輝, 徐寶才

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

血紅蛋白是一種低廉的蛋白質資源,約占血液總蛋白質質量分數(shù)的80%。血紅蛋白含有約4%的血紅素,它導致血紅蛋白腥味和不良色澤,限制了血紅蛋白在食品工業(yè)中的應用[1]。脫血紅素對于血紅蛋白的使用很有必要。

目前為止,已開發(fā)一系列血紅蛋白脫血紅素的方法。文獻[2]在pH值為4的酸性條件下使用丙酮溶液(80%)分離血紅素鐵,但存在成本高、有機溶劑耗損高等缺點;文獻[3]在pH值為3.0條件下用羧甲基淀粉鈉吸附血紅素的方法去除血紅素鐵,但效果有限;文獻[4]用過氧化氫水溶液氧化血紅素鐵進行脫色,但存在過氧化氫殘留等缺點。表面活性劑已被證明可有效分離血紅素鐵和珠蛋白[5],有工藝簡單、成本低和效率高等優(yōu)點。

因溶解度、凝膠性和乳化性差,珠蛋白難以直接用于食品加工。文獻[6]采用羧甲基纖維素法從牛血紅蛋白制備的珠蛋白溶解度低、乳化能力差。因此,珠蛋白分子在使用前必須進行修飾以改善其功能特性。酶水解被認為是提高蛋白質溶解性等功能性質的有效方法。研究證明玉米醇溶蛋白水解物可改善肌原纖維蛋白基水包油乳液的乳化和氧化穩(wěn)定性[7]。在中性條件下,添加9%大豆肽的蛋清粉具有最佳發(fā)泡性能[8]。添加超過20 g/kg的豬血漿水解物可抑制微生物的生長,并改善乳化香腸的質地[9]。因此,以蛋白質水解物改善食品品質引起了學者的廣泛興趣。然而,關于珠蛋白水解物在食品制造中應用的相關報道很少。肌球蛋白具有乳化和凝膠等性質,對最終產品的保水、保油和質構等品質屬性具有決定性影響[10]。珠蛋白水解物是血球蛋白粉通過脫色和酶解工藝處理得到的產物。因此,本文通過比較血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物對肌球蛋白大豆油乳液理化性質的影響,研究脫色和酶解對血球蛋白粉理化性質的影響,為血球蛋白粉在食品工業(yè)中的應用奠定基礎。研究結果將為畜禽血液的深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

血球蛋白粉(三元龍勝有限公司);大豆油(合家福超市);表面活性劑(國藥集團化學試劑有限公司);胃蛋白酶(10 000 U/g)(宏潤寶順科技有限公司);其他試劑均為分析純。

從大潤發(fā)超市購買4批新鮮豬后腿肉。在去除所有肉眼可見的結締組織和脂肪后,將豬后腿肉切成塊狀(約2 cm×2 cm×2 cm),并用食物切碎機切碎2次(每次1 min)。

1.1.2 設備

GL-21M型高速冷凍離心機(湘儀儀器開發(fā)有限公司);WTC10002型電子天平(杭州萬特衡儀器有限公司);PHS-3E型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);HH-54型水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);K9840型凱氏定氮儀(海能科學儀器有限公司);PD500型高速剪切乳化機(PRIMA(德國));TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡(徠卡(德國)照相機有限公司)。

1.2 實驗方案

1.2.1 珠蛋白的制備

根據(jù)文獻[5]的方法制備珠蛋白,向血球蛋白粉溶液(7.6 g血球蛋白粉溶于300 mL蒸餾水)中加入100 mL 質量分數(shù)為4%的表面活性劑溶液,使用12 mol/L鹽酸將混合物的pH值調至1.5,然后將混合物水浴從40 ℃加熱至80 ℃。在混合物顏色從紅色變?yōu)樽仙⑶移渖蠈映霈F(xiàn)白色泡沫后,繼續(xù)將混合物加熱5 min,然后冷卻至室溫。在13 000g離心15 min后,用10 mol/L氫氧化鈉溶液將上清液的pH值調節(jié)至7.0。將上清液在4 450g下離心15 min,用400目尼龍濾網收集沉淀物(珠蛋白),并用蒸餾水潤洗2次,然后在氣壓小于10 Pa下冷凍干燥24 h。收集干燥的沉淀物即為珠蛋白。

1.2.2 珠蛋白水解物的制備

由1.2.1獲得的珠蛋白被用于制備珠蛋白水解物,向珠蛋白溶液(20 mg/mL)加入250 U/g的胃蛋白酶,用濃鹽酸將pH值調至1.5,37 ℃下孵育1 h后使用10 mol/L氫氧化鈉將pH值調節(jié)至7.0;然后將混合物在沸水中加熱10 min以使酶失活。在11 300g離心15 min后收集上清液,并在氣壓小于10 Pa下冷凍干燥24 h。珠蛋白水解物在4 ℃條件下保存待用。

1.2.3 大豆油預處理

根據(jù)文獻[11]的方法去除大豆油中的生育酚,大豆油和氧化鋁(質量比2∶1)混合并避光攪拌24 h,離心(4 000g,10 min)后去除沉淀。收集處理后的大豆油備用。

1.2.4 肌球蛋白提取

按照文獻[10]的方法提取肌球蛋白,使用雙縮脲法測定提取的肌球蛋白濃度,并用PBS緩沖液(0.6 mol/L KCl、10 mmol/L 磷酸鉀溶液, pH值 6.5)將肌球蛋白稀釋到8 mg/mL并在4 ℃下儲存,48 h內使用完。

1.2.5 肌球蛋白大豆油乳液的制備

按照文獻[10]的方法制備肌球蛋白大豆油乳液。將48 g肌球蛋白和12 g大豆油的混合物在10 000 r/min下均質2 min,分別將質量分數(shù)為0.08%的血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物與48 g肌球蛋白充分混合并在相同條件下均質,依次命名為乳液1～乳液4。向乳液中添加疊氮化鈉(0.2 mg/mL)以防止微生物繁殖。所有乳液在25 ℃條件下儲藏。

1.2.6 溶解度的測定

血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物溶解度根據(jù)文獻[12]的方法進行測定。血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物(20 g/L)溶解在100 mL的PBS緩沖液中,充分攪拌混勻后在10 000g離心20 min,然后將沉淀冷凍干燥并稱重。使用凱氏定氮儀測定血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物及其各自在PBS緩沖液中沉淀物的蛋白質質量分數(shù)。并計算其溶解度,具體公式如下:

溶解度=[(m0w0-m1w1)/(m0w0)]×100%,

其中:m0為血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物的初始質量;m1為凍干后沉淀的質量;w0為血紅蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物中蛋白質的質量分數(shù);w1為凍干后沉淀中蛋白質質量分數(shù)。

1.2.7 鐵離子質量比測定

根據(jù)GB 5009.268—2016[13]測定血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中鐵離子質量比。

1.2.8 分層指數(shù)及乳化性質測定

分層指數(shù)根據(jù)文獻[14]的方法測定。

按照文獻[11]的方法測定乳化活力指數(shù)(emulsification activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsion stability index,ESI)。

1.2.9 乳液粒徑分布及體積平均粒徑

根據(jù)文獻[14]的方法使用百特激光粒度儀測定乳液第1、3、5天的粒徑分布和體積平均粒徑(D4,3)。

1.2.10 顯微結構的測定

根據(jù)文獻[15]的方法,在第1、3、5天觀察乳液的光學顯微鏡圖像。用等體積PBS緩沖液稀釋乳液,稀釋后的乳液(50 μL)滴在載玻片上并用蓋玻片壓緊,以確保沒有氣泡。在物鏡下觀察樣品,每個樣品隨機觀察至少3個不同的位置。

在第1、3、5天,使用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察乳液中的油和蛋白質分布[14]。在每種情況下隨機捕獲至少3個不同的位置。

1.2.11 脂質氧化的測定

采用文獻[11]方法測量乳液在室溫下1、3、5 d的過氧化值;使用分光光度法測定乳液在室溫下1、3、5 d的硫代巴比妥酸值[11]。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次,結果以(平均值±標準差)表示。使用SPSS 25.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)評估。不同大寫字母(A～C)表示相同處理下、不同儲存時間下的結果有顯著性差異;不同小寫字母(a～d)表示在相同儲存時間、不同處理下的結果有顯著性差異;P<0.05表示有顯著差異,P>0.05表示無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 溶解度和鐵離子質量比分析

2.1.1 溶解度

溶解度與蛋白質的功能特性密切相關,如凝膠和乳化性。血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的溶解度見表1所列,從表1可以看出,珠蛋白在PBS緩沖液中的溶解度(1.07%)明顯低于血球蛋白粉(74.44%)(P<0.05)。這可能是由于珠蛋白制備過程中在強酸和加熱條件下發(fā)生變性(更多的疏水基團暴露)[16]。此外,PBS緩沖液的pH值接近珠蛋白的等電點(pI≈7.0)[6],這也是珠蛋白溶解度較低的原因。溶解度低的蛋白質通常具有較差的乳化和膠凝性能。因此,使用胃蛋白酶水解珠蛋白以提高溶解度。珠蛋白水解物在PBS緩沖液中的溶解度達到95.80%。文獻[8]的研究發(fā)現(xiàn),從牛血中提取的珠蛋白的溶解度在經過胃蛋白酶限制性水解后顯著提高。

表1 血球蛋白粉、珠蛋白及其水解物的溶解度和鐵離子質量比

2.1.2 鐵離子質量比

鐵離子能夠催化蛋白質和脂質的氧化。脂質氧化易導致食品質量降低、保質期縮短,并生成有害物質,如醛類和酮類物質。此外,蛋白質氧化可導致結構變化和功能特性降低[17](如凝膠性和乳化性)。因此,最大限度地去除血紅素鐵,對于拓展血紅蛋白在食品工業(yè)中的應用至關重要。

血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的鐵離子質量比見表1所列。由表1可知,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中的鐵離子質量比分別為2 210.0、385.5、2.6 mg/kg。結果表明:在珠蛋白制備過程中,血球蛋白粉中約82.56%的鐵離子被去除。這可能歸因于在酸性、加熱和表面活性劑共同作用下,血紅蛋白中大多數(shù)血紅素分離和沉淀[6];在酶水解期間,珠蛋白中約99.32%的鐵離子被去除,這可能歸因于酶水解期間珠蛋白中殘余血紅素的釋放[18]。珠蛋白制備和酶水解過程中鐵離子質量比的降低可能對擴大血紅蛋白及其衍生物在食品工業(yè)和其他領域的利用具有重要意義。

2.2 分層指數(shù)分析

分層指數(shù)用于反映儲存期間乳液的物理穩(wěn)定性。不同處理對肌球蛋白大豆油乳液分層指數(shù)的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著儲存時間延長,所有樣品中的分層指數(shù)增加,這可能歸因于肌球蛋白大豆油乳液的熱力學不穩(wěn)定性[14]。乳液2的分層指數(shù)在120 h下降到30.13%,表明血紅蛋白可顯著提高肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性。此外,文獻[18]報道血紅蛋白可以作為乳化劑,吸附在大豆油水界面上。乳液3在儲存期間的分層指數(shù)略高于乳液1(P>0.05),表明珠蛋白不能有效影響肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性,這可能與珠蛋白溶解度差有關。如上所述,乳化性能是蛋白質的重要功能特性。目前的研究表明,珠蛋白不適合用于食品加工。在所有乳液中,乳液4在120 h時具有最低分層指數(shù)(16.96%),表明珠蛋白水解物在改善肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性方面比血球蛋白粉更有效。文獻[7]的研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白水解物降低了肌原纖維蛋白制備的水包油乳液的分層指數(shù),并提高EAI和ESI。文獻[19]的研究發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物能夠提高基于大豆分離蛋白的O/W乳液的蛋白質覆蓋率。上述文獻推測,由于玉米蛋白水解物與大豆分離蛋白、玉米醇溶蛋白水解物與肌原纖維蛋白之間的非共價相互作用,使得玉米蛋白水解產物、玉米醇溶蛋白水解物吸附到油水界面,并增加界面蛋白的覆蓋率。因此,珠蛋白水解物可能吸附在大豆油水界面上,并增加界面蛋白的覆蓋率,從而在當前條件下降低分層指數(shù)。本文研究結果表明,血紅蛋白及其水解物均能有效改善肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性,在乳化食品生產中具有一定潛力。

圖1 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液分層指數(shù)的的影響

2.3 乳化性質分析

EAI反映蛋白質快速結合液滴界面的能力,ESI反映蛋白質在一段時間內保持乳液穩(wěn)定的能力[20]。為了評估新制備乳液的物理穩(wěn)定性,本研究測定了EAI和ESI。

不同處理對肌球蛋白大豆油乳液的EAI和ESI影響如圖2所示。從圖2a可以看出:乳液2的EAI略高于乳液1(P>0.05),表明血球蛋白粉不能有效影響肌球蛋白大豆油乳液的EAI;考慮到乳液2中加入血球蛋白粉的量相當于肌球蛋白的10%以及EAI的定義,可以推測血紅蛋白被吸收至大豆油水界面且展開;乳液3的EAI最低(17.85 m2/g),表明珠蛋白在大豆油水界面既不吸附也不展開,這可能與珠蛋白的溶解度差和剛性結構密切相關[6];乳液4具有最高的EAI(25.98 m2/g),表明珠蛋白水解物增強了肌球蛋白大豆油乳液的EAI。文獻[19]的研究發(fā)現(xiàn),玉米蛋白水解物通過非共價相互作用導致更多大豆分離蛋白吸附到界面上。文獻[21]提出肽可以通過非共價相互作用與蛋白質特異性結合,這些作用改變蛋白質肽系統(tǒng)的凝膠、乳化和其他功能特性。因此,珠蛋白水解物能導致更多的肌球蛋白吸附在大豆油水界面上,并提高肌球蛋白的EAI。另外,文獻[22]發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解使得綠豆蛋白結構從剛性轉化為柔性。珠蛋白經胃蛋白酶水解后結構可能由剛性轉化為柔性,方便其吸附至大豆油水界面上并導致覆蓋率的增加,即有更高的EAI。

圖2 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液乳化性質的影響

由圖2b可知,不同乳液之間的ESI差異與分層指數(shù)中的差異一致。

2.4 乳液粒徑分布和體積平均粒徑(D4,3)分析

乳液的粒徑分布和體積平均粒徑(D4,3)通常用于反映乳液的物理穩(wěn)定性。不同處理對肌球蛋白大豆油乳液粒徑分布的影響結果如圖3所示。

圖3 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液粒徑分布的影響

由圖3可知,乳液液滴尺寸主要分布在4～400 μm的范圍內,且隨著儲藏時間的延長所有乳液的粒徑均向較大顆粒尺寸的方向移動,表明發(fā)生了液滴的絮凝和聚集。這可能是肌球蛋白大豆油乳液的熱力學不穩(wěn)定性導致的。

由圖3可知,乳液3的分布峰與乳液1的分布峰相似;與乳液1相比,乳液2和乳液4的分布峰均向較小尺寸的方向移動,后者的移動更為顯著。為了定量描述不同乳液在儲存過程中的變化,使用激光粒度分布分析軟件(Ver 6.0)進一步計算它們的體積平均粒徑,結果見表2所列。由表2可知,乳液3和乳液1的D4,3在整個儲存過程中顯著增加(P<0.05),而乳液2和乳液4的D4,3在最初3 d顯著增加(P<0.05),但在接下來的2 d內沒有顯著變化(P>0.05)。結果表明:珠蛋白對乳液液滴粒徑的影響較小;血球蛋白粉和珠蛋白水解物均顯著降低乳液液滴粒徑,且珠蛋白水解物比血球蛋白粉更有效。乳液液滴粒徑的增加與其在儲存期間的聚集和絮凝密切相關。

表2 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液D4,3的影響

因此,本研究結果表明,血球蛋白粉和珠蛋白水解物都有效抑制了乳液中液滴的絮凝和聚集,且珠蛋白水解物的效果優(yōu)于血球蛋白粉。這可能與珠蛋白水解物可以增加肌球蛋白大豆油乳液界面的蛋白質覆蓋率有關。文獻[7]的研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白水解物降低了肌原纖維蛋白制備的水包油乳液的D4,3。該結果與上述EAI、ESI和分層指數(shù)的結論一致。

2.5 乳液微觀結構分析

使用40倍CLSM物鏡和20倍光學顯微鏡觀察乳液的微觀結構。不同處理對乳液微觀結構的影響如圖4所示。

圖4 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液微觀結構的影響

通過CLSM可以直觀地觀察乳液中的蛋白質(紅色)和油滴(綠色)。

由圖4a可知,在所有樣品中,隨著儲存時間的延長,液滴變得更大。在相同的儲存時間時,乳液1和乳液3中發(fā)現(xiàn)了嚴重的絮凝和聚集,而乳液2和乳液4在儲存過程中發(fā)現(xiàn)了輕微的絮凝和聚集。此外,與乳液2和乳液4相比,絮凝和聚集明顯受到抑制。這與D4,3一致,并為不同處理引起的肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性(分層指數(shù)、EAI和ESI)差異提供了合理的解釋。由圖4b可知,使用光學顯微鏡也觀察到類似的現(xiàn)象。由于絮凝和聚集,空白組中觀察到大液滴;血球蛋白粉和珠蛋白水解物抑制肌球蛋白大豆油乳液在儲存過程中的絮凝和聚集,且珠蛋白水解物更有效;然而,珠蛋白很少有效。珠蛋白水解物處理使液滴很少絮凝,更加均勻。這些結果與上述分層指數(shù)、ESI和D4,3的結果一致。

2.6 脂質氧化分析

脂質氧化程度被認為是反映乳液化學穩(wěn)定性的重要指標之一,與食品風味和可接受性密切相關[23]。過氧化物和硫代巴比妥酸是脂質氧化的一級和二級產物。因此,在第1、3、5天測定了肌球蛋白大豆油乳液中過氧化值和硫代巴比妥酸值。

不同處理對肌球蛋白大豆油乳液脂質氧化的影響如圖5所示。由圖5可知,隨著儲存時間的延長,所有乳液的過氧化值和硫代巴比妥酸值均顯著增加(P<0.05)。在相同的儲存時間內,過氧化值從大到小依次為乳液2、乳液3、乳液4、乳液1,不同乳液之間的過氧化值差異顯著(P<0.05),特別是乳液2與乳液3和乳液4之間。與未經任何處理的肌球蛋白大豆油乳液相比,在第1天,用珠蛋白或血球蛋白粉處理的乳液中的硫代巴比妥酸值顯著高于空白組(P<0.05),用珠蛋白水解物處理的乳液略高于空白組(P>0.05);然而,在第3天和第5天不同乳液之間的過氧化值的差異與硫代巴比妥酸值的差異相似。結果表明,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物都能夠加速脂質氧化,其能力從高到低依次為血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物。鐵離子是一種重要的促氧化劑,能夠催化脂質氧化[24]。因此,目前的結果可能與血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中的鐵離子質量比有關。血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的鐵離子質量比分別為2 210.0、385.5、2.6 mg/kg。鐵離子質量比越低,促進脂質氧化程度越小。

圖5 不同處理對肌球蛋白大豆油乳液脂質氧化的影響

如前所述,脂質氧化通常導致營養(yǎng)物質損失、不良氣味,甚至形成有害物質,對食品質量和安全造成不利影響。因此,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物在食品制造中的應用可能受到限制。然而,與血球蛋白粉相比,珠蛋白尤其是珠蛋白水解物加速脂質氧化的能力非常弱,這與它們中鐵離子含量有關。結果表明,通過去除血球蛋白粉及其衍生物中鐵離子可以在很大程度上降低脂質氧化的程度,對畜禽血液的綜合利用有一定的實際意義。

3 結 論

與血球蛋白粉和珠蛋白相比,珠蛋白水解物在增強肌球蛋白大豆油乳液的物理穩(wěn)定性方面更有效,并且顯示出較弱的促進氧化特性。結果表明,通過去除血紅素鐵和酶水解可以改善血球蛋白粉的乳化性能,并顯著抑制其促進氧化能力,在食品工業(yè)中的應用具有一定潛力。本研究為畜禽血液的綜合利用提供了依據(jù)。