蔣蘭蘭, 陳向濤, 儲 濤, 蔡靜雯,2, 劉浩宇, 尹蘭香

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230022; 2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院) 藥劑科,安徽 合肥 230001)

隨著人口老齡化的加劇,全球神經(jīng)退行性疾病的負(fù)擔(dān)正在以驚人的速度增加。雖然導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的分子機(jī)制還不完全清楚,但興奮性毒性已被證明在其中起著關(guān)鍵的作用[1]。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在記憶、突觸可塑性和神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[2],但是谷氨酸被認(rèn)為是“雙刃劍”,既是神經(jīng)遞質(zhì)又可以作為神經(jīng)毒素。谷氨酸過度釋放會導(dǎo)致Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào),觸發(fā)Ca2+下游信號通路的改變,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的過程稱為興奮性毒性,其中Ca2+超載是興奮性毒性的主要發(fā)病機(jī)制[3]。由于谷氨酸損傷神經(jīng)系統(tǒng)具有多靶點(diǎn)效應(yīng),谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)毒性機(jī)制是一個(gè)重要的研究課題。

瞬時(shí)受體電位香草素受體4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是一種廣泛表達(dá)、多模態(tài)門控[4]、非選擇性Ca2+通道參與多種病理和生理反應(yīng)[5]。當(dāng)它被內(nèi)源性和外源性刺激激活時(shí),Ca2+內(nèi)流增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+超載[6]。在許多類型的細(xì)胞中,TRPV4的活性增加會導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NO的產(chǎn)生[7],在許多病理過程中會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8],是腦疾病[9]發(fā)生的危險(xiǎn)因素,包括腦出血[10]、腦水腫[11]、癲癇[12]和阿爾茨海默病[13]。TRPV4的激活上調(diào)參與腦缺血時(shí)的神經(jīng)元損傷[14],導(dǎo)致神經(jīng)元Ca2+超載[15]。TRPV4在細(xì)胞毒性方面的作用越來越受到研究者的關(guān)注,然而有關(guān)TRPV4是否參與谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載報(bào)道并不多。

高分化的PC12 細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株,具有豐富的神經(jīng)元性質(zhì)和特征,近年來,廣泛用于細(xì)胞神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究。β-細(xì)辛醚是石菖蒲的主要揮發(fā)油成分,具有抗炎、抗腫瘤等作用,對谷氨酸所致 PC12細(xì)胞損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)深入探究β-細(xì)辛醚對40 mmol/L谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的抑制作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷氨酸(Sigma-Aldrich);β-細(xì)辛醚(成都曼思特生物科技有限公司);胎牛血清(四季青),DMEM不完全高糖培養(yǎng)基、EDTA細(xì)胞消化液(江蘇凱基生物公司);Fluo-4 AM(上海同仁化學(xué)研究所);Cell Counting Kit-8 (碧云天);Axygen小量制備總RNA試劑盒(Axygen Silicon Valley);SYBR@Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(AG);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、化學(xué)發(fā)光顯影液(北京全式金生物技術(shù)有限公司);脫脂牛奶(伊利);PVDF膜(Millipore);Triton X-100、抗熒光猝滅劑(索萊寶);DAPI(Invitrogen);Anti-TRPV4 (Alomone公司);GAPDH、HRP-羊抗兔IgG、羊抗兔FITC(博士德);NC-siRNA、TRPV4-siRNA、pEX-3-Ctrl、pEX-3-TRPV4試劑(GenePharma);Lipofectamine 2000 (Invitrogen);其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

化學(xué)發(fā)光顯影儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(Bio-Rad Company,USA);恒溫CO2培養(yǎng)箱(The Thermo Company);倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯);恒溫?fù)u床(上海天能科技有限公司);離心機(jī)(Bio-Rad Company)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的濕度環(huán)境中培養(yǎng),添加不完全高糖DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,PC12細(xì)胞分別用不同濃度的β-細(xì)辛醚(終濃度為15、30、60 μmol/L)預(yù)處理4 h后去除溶液,40 mmol/L谷氨酸處理PC12細(xì)胞,實(shí)時(shí)記錄Ca2+濃度的變化。在實(shí)驗(yàn)中,谷氨酸溶解于HBSS溶液中 (136.9 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、1.3 mmol/L CaCl2、0.4 mmol/L MgSO4·7H2O、0.5 mmol/L MgCl2·6H2O、0.3 mmol/L Na2HPO4·2H2O、0.4 mmol/L KH2PO4、5.6 mmol/L葡萄糖、4.2 mmol/L NaHCO3,調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4),對照組給予等量的HBSS溶液。β-細(xì)辛醚溶于二甲基亞砜(DMSO)中,形成100 mmol/L儲備液,保存于-20 ℃。DMSO的最終體積分?jǐn)?shù)小于0.1%。實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、 谷氨酸模型組(B組)、谷氨酸+15 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(C組)、谷氨酸+30 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(D組)和谷氨酸+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E組)。

1.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力

PC12細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基中,細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種在96孔板,培養(yǎng)12 h后,用β-細(xì)辛醚(15、30、60、80、100 μmol/L)孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL 無血清培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育90 min,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定A值。

1.3.3 鈣成像技術(shù)檢測胞內(nèi)Ca2+濃度

細(xì)胞培養(yǎng)48 h,β-細(xì)辛醚孵育4 h,用Ca2+熒光探針Fluo-4 AM測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。加入HBSS溶液稀釋的2.5 μmol/L Fluo-4 AM在培養(yǎng)箱中孵育40 min,用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次。加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)箱孵育25 min,棄除HBSS溶液。使用倒置熒光顯微鏡,在488 nm波長下激發(fā)PC12細(xì)胞,10倍物鏡將激發(fā)光聚焦于細(xì)胞。每組至少圈出85個(gè)細(xì)胞,40 mmol/L谷氨酸處理PC12細(xì)胞實(shí)時(shí)記錄Ca2+濃度的變化。利用MetaFluor軟件對圖像進(jìn)行采集和分析。計(jì)算Ca2+濃度時(shí),每個(gè)熒光中減去非特異性Ca2+熒光。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TRPV4的表達(dá)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板48 h,β-細(xì)辛醚孵育4 h,谷氨酸處理5 min;將培養(yǎng)板置于冰上,預(yù)冷的1×PBS洗3次后棄去;加入300 μL Buffer R-1,反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管并加入150 μL Buffer R-Ⅱ,渦旋機(jī)混勻30 s,12 000g、4 ℃離心5 min;取上清至2 mL離心柱中,加入200 μL異丙醇,6 000g、4 ℃離心1 min;棄濾液,加入500 μL Buffer W1A,12 000g、4 ℃離心1 min;棄濾液,加入700 μL Buffer W2,12 000g、4 ℃離心1 min;棄濾液,重復(fù)上述加入Buffer W2步驟1次;棄濾液,12 000g、4 ℃離心空轉(zhuǎn)1 min;將離心柱放入新的1.5 mL EP管中并加入30 μL TE-Buffer,室溫靜置1 min,12 000g、4 ℃離心1 min,所得濾液為各組細(xì)胞RNA。將制備好的RNA用NanoDrop2000分光光度計(jì)進(jìn)行定量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書加樣反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板,在目標(biāo)基因的上下游引物作用下,加入熱穩(wěn)定的DNA聚合酶針對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分析。

GAPDH作為內(nèi)參基因,引物上游序列為:

5′-AGCCCTCCCTTCTCTCGAAT-3′;

下游序列為:

5′-CCCCACAACACTGCATTCAC-3′。

TRPV4作為目的基因,上游序列為:

5′-GGAACCATCCACAGGGAAGA-3′;

下游序列為:

5′-CACTGGGATGGTGTCGTTTC-3′。

1.3.5 Western Blot技術(shù)檢測TRPV4的表達(dá)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板48 h,β-細(xì)辛醚孵育4 h,谷氨酸處理5 min,預(yù)冷的1×PBS洗滌2次。每組加入150 μL Laemmli裂解液,得到全細(xì)胞蛋白提取液,沸水中變性10 min得到蛋白樣品。用BCA法測蛋白濃度,蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳壓縮并分離目的蛋白。將分離的蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)移到PDVF膜上進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移。在室溫脫脂牛奶中阻斷印跡1 h,一抗(1∶1 000)覆蓋,4 ℃冰箱孵育過夜,PBST洗滌3次后用二抗(1∶1 000)覆蓋,室溫孵育1 h廣泛洗滌。采用化學(xué)發(fā)光法顯影,用Image J對樣品條帶進(jìn)行量化分析。

1.3.6 免疫化學(xué)技術(shù)檢測TRPV4的表達(dá)

PC12細(xì)胞接種在24孔板多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,培養(yǎng)48 h后,β-細(xì)辛醚孵育4 h,谷氨酸處理5 min,預(yù)冷的1×PBS清洗2遍。4%多聚甲醛固定15 min,1×PBS慢速清洗3次。 0.5% Triton X-100 通透10 min,清洗3次,5% BSA封閉1 h并清洗,200 μL anti-TRPV4 (1∶100)覆蓋,4 ℃冰箱孵育過夜,次日取出,室溫復(fù)溫1 h,熒光二抗(1∶1 000)覆蓋,室溫孵育1 h,加入300 μL DAPI原液,室溫避光靜置20 min,洗滌細(xì)胞2次。在載玻片上滴一小滴抗熒光猝滅劑,將蓋玻片倒扣在載玻片上。透明指甲油封片,40倍物鏡進(jìn)行熒光成像。

1.3.7 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)轉(zhuǎn)染NC-siRNA、TRPV4-siRNA、pEX-3-Ctrl和pEX-3-TRPV4試劑,將 Lipofectamine 2000和Opti-MEM混勻配制轉(zhuǎn)染混合液,將NC-siRNA、TRPV4-siRNA、pEX-3-Ctrl、pEX-3-TRPV4和Opti-MEM 混勻配制稀釋液,將轉(zhuǎn)染混合液與稀釋液混合靜置20 min,轉(zhuǎn)移至對應(yīng)組別中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,將培養(yǎng)液更換成高糖DMEM,過夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再次進(jìn)入對數(shù)生長期且密度合適時(shí),對細(xì)胞加藥處理。沉默TRPV4實(shí)驗(yàn)分為NC-siRNA組(A1組)、Ctrl+TRPV4-siRNA組(B1組)、 谷氨酸+NC-siRNA組(C1組)、谷氨酸+TRPV4-siRNA組(D1組)和谷氨酸+NC-siRNA+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E1組);過表達(dá)TRPV4實(shí)驗(yàn)分為pEX-3-Ctrl組(A2組)、 Ctrl+pEX-3-TRPV4組(B2組)、谷氨酸+pEX-3-Ctrl組(C2組)、谷氨酸+pEX-3-TRPV4+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(D2組)和谷氨酸+pEX-3-Ctrl+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E2組)。NC-siRNA上游序列為:

5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;

下游序列為:

5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

TRPV4-siRNA上游序列為:

5′-GGAGUCCUGUUCUUCUUUATT-3′;

下游序列為:

5′-UAAAGAAGAACAGGACUCCTT-3′。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行處理和分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。以P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***),P<0.000 1(****)作為顯著性水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-細(xì)辛醚對Ca2+濃度的影響

本文采用高分化的PC12細(xì)胞培養(yǎng)48 h,用β-細(xì)辛醚預(yù)先培養(yǎng)PC12細(xì)胞4 h,再用谷氨酸實(shí)時(shí)處理PC12細(xì)胞,測定Ca2+濃度和TRPV4的表達(dá);沉默和過表達(dá)TRPV4檢測PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

β-細(xì)辛醚對谷氨酸處理PC12細(xì)胞Ca2+濃度的影響如圖1所示。

圖1 β-細(xì)辛醚對谷氨酸處理PC12細(xì)胞Ca2+濃度的影響

圖1中,NS表示無顯著差異。從圖1a可以看出,PC12細(xì)胞用不同濃度β-細(xì)辛醚處理24 h后細(xì)胞活力沒有降低;從圖1b、圖1c可以看出,與正常對照組(A組)相比,40 mmol/L谷氨酸(B組)處理PC12細(xì)胞導(dǎo)致Ca2+濃度顯著增加,說明細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化;與B組相比,谷氨酸+15 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(C組)、谷氨酸+30 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(D組)和谷氨酸+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E組)分別用不同濃度的β-細(xì)辛醚預(yù)先處理PC12細(xì)胞4 h明顯抑制Ca2+濃度的增加,抑制效果具有劑量依賴性。結(jié)果表明,β-細(xì)辛醚能夠抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Ca2+超載。

2.2 β-細(xì)辛醚對TRPV4表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot和免疫熒光技術(shù)評估谷氨酸處理及不同濃度β-細(xì)辛醚對TRPV4表達(dá)的影響,如圖2、圖3所示。

圖2 TRPV4 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖3 TRPV4熒光圖

由圖2、圖3可知,與A組相比,B組TRPV4在mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯升高;與B組相比,C組、D組和E組有效地抑制TRPV4 mRNA和蛋白的表達(dá),抑制效果呈劑量依賴性。結(jié)果表明,40 mmol/L谷氨酸處理PC12細(xì)胞提高了TRPV4的表達(dá),β-細(xì)辛醚預(yù)先處理PC12細(xì)胞4 h劑量依賴性地降低了TRPV4的表達(dá)。TRPV4通道是否參與谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載有待深入研究。

2.3 沉默TRPV4對Ca2+濃度的影響

為了研究TRPV4通道在谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Ca2+超載中的作用,實(shí)驗(yàn)構(gòu)建TRPV4-siRNA載體來沉默TRPV4的表達(dá),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot確定轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果如圖4所示。

圖4 TRPV4-siRNA載體沉默TRPV4的表達(dá)

從圖4可以看出,與NC-siRNA組(A1組)相比,Ctrl+TRPV4-siRNA組(B1組)中TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低;與谷氨酸+NC-siRNA組(C1組)相比,谷氨酸+TRPV4-siRNA組(D1組)中TRPV4 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低。因此,TRPV4-siRNA載體構(gòu)建成功。與C1組相比,谷氨酸+NC-siRNA+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E1組)中β-細(xì)辛醚預(yù)先處理4 h顯著降低TRPV4的表達(dá)。

隨后對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出,與A1組相比,C1組Ca2+濃度明顯上升;與C1組相比,D1組和E1組都顯著降低Ca2+濃度水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默TRPV4和預(yù)先給與60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚處理兩者均能明顯降低谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載。

圖5 沉默TRPV4對Ca2+濃度的影響

2.4 過表達(dá)TRPV4對Ca2+濃度的影響

為進(jìn)一步探究β-細(xì)辛醚降低谷氨酸誘導(dǎo)Ca2+超載的靶點(diǎn),實(shí)驗(yàn)構(gòu)建pEX-3-TRPV4載體過表達(dá)TRPV4,采用熒光定量PCR和Western Blot技術(shù)確定轉(zhuǎn)染效率,如圖6所示。

圖6 pEX-3-TRPV4載體過表達(dá)TRPV4

從圖6可以看出:與pEX-3-Ctrl組(A2組)相比,Ctrl+pEX-3-TRPV4組(B2組)的TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加;與A2組相比,谷氨酸+pEX-3-Ctrl組(C2組)的TRPV4表達(dá)明顯增加;與谷氨酸+pEX-3-Ctrl+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(E2組)相比,谷氨酸+pEX-3-TRPV4+60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚組(D2組)部分逆轉(zhuǎn)了β-細(xì)辛醚抑制TRPV4的表達(dá)。因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot結(jié)果表明,pEX-3-TRPV4載體構(gòu)建成功。

本文對Ca2+濃度進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖7所示。

圖7 過表達(dá)TRPV4對Ca2+濃度的影響

從圖7可以看出:與A2組相比,C2組Ca2+濃度顯著升高;與C2組相比,E2組Ca2+濃度顯著減少;與E2組相比,D2組過表達(dá)TRPV4部分逆轉(zhuǎn)了60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚抑制谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+濃度的增加。鈣成像結(jié)果表明,60 μmol/Lβ-細(xì)辛醚能夠抑制谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載;過表達(dá)TRPV4能夠促進(jìn)谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載。

3 結(jié) 論

鑒于Ca2+超載是導(dǎo)致興奮性毒性細(xì)胞死亡的主要途徑,本研究表明谷氨酸可以引起PC12細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂,β-細(xì)辛醚劑量依賴性地抑制谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載;谷氨酸促進(jìn)TRPV4的表達(dá),β-辛醚劑量依賴性地抑制TRPV4的表達(dá)。為了探究β-辛醚降低谷氨酸誘導(dǎo)Ca2+超載的作用靶點(diǎn),構(gòu)建TRPV4-siRNA和pEX-3-TRPV4載體來沉默和過表達(dá)TRPV4。結(jié)果表明:沉默TRPV4顯著緩解了谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載;過表達(dá)TRPV4促進(jìn)了谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+超載。

上調(diào)TRPV4的表達(dá)可增強(qiáng)Ca2+超載,促進(jìn)谷氨酸毒性。下調(diào)TRPV4的表達(dá)可能間接作用于谷氨酸受體有效抑制Ca2+超載。谷氨酸毒性是一種復(fù)雜的損傷,研究表明,β-細(xì)辛醚作為TRPV4的拮抗劑,是抑制興奮性毒性的潛在藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提高了人們對谷氨酸毒性發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識,并為谷氨酸毒性的治療提供了新的靶點(diǎn)。