吳仲秋, 牛向麗, 汪雯靜, 李 璇, 劉駿菲, 鄔杰濤

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

獼猴桃(Actinidiaspp.)是一種多年生落葉藤本果樹隸屬于猴桃科獼猴桃屬[1],因其果實獨特的口感風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)成分而深受消費者喜愛。獼猴桃原產(chǎn)于中國,但其馴化卻始于19世紀(jì)末20世紀(jì)初獼猴桃種質(zhì)資源從中國流出后。在20世紀(jì)30年代新西蘭馴化開發(fā)了綠果美味獼猴桃品種‘海沃德’(A.deliciosa‘Hayward’),并逐漸在世界各地引種。較大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)在20世紀(jì)80年代開始興起[2],隨后培育的中華獼猴桃(A.chinensis)‘Hort16A’、黃果品種‘金桃’、紅果品種‘紅陽’也被商業(yè)化,在中國、新西蘭及歐亞等地廣泛種植[3]。

在獼猴桃馴化和農(nóng)業(yè)化種植早期,并未報道有嚴(yán)重病害。但伴隨單一克隆品種的規(guī)?；N植,1984年在日本發(fā)現(xiàn)潰瘍病,1989年分離丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)[4]。Psa是一種革蘭氏陰性菌,通過氣孔、皮孔、脫落疤痕、修剪切口等自然開口或傷口,可進入所有類型獼猴桃組織,并通過在維管系統(tǒng)中定植而實現(xiàn)系統(tǒng)性傳播,危害獼猴桃的葉、芽、枝干等部位,出現(xiàn)葉斑壞死、枝干腐爛、嫩枝枯死、果斑結(jié)痂等潰瘍病癥狀[5-7]。2008—2010年強致病性Psa在不同國家的不同品種獼猴桃種植區(qū)快速傳播,導(dǎo)致潰瘍病大爆發(fā),對全球范圍獼猴桃產(chǎn)區(qū)造成了持續(xù)的經(jīng)濟損失,也嚴(yán)重影響了我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8-10]。

目前,國內(nèi)外對獼猴桃潰瘍病的研究已取得顯著進展,尤其是在潰瘍病起源和傳播方式、鑒定方法以及各獼猴桃種質(zhì)資源的感病性等方面[11-16],而對Psa致病基因及其分子機制仍有待深入研究。因此,分離鑒定具有致病性差異的Psa菌株成為探討其病原-宿主植物互作機制的一個重要切入點。

本研究利用采集于四川省(獼猴桃重要產(chǎn)區(qū)之一)不同種植區(qū)的潰瘍病染病枝條,對Psa病原菌進行分離、鑒定,并通過植物接種對其致病性進行檢測,以獲取更具多樣性的Psa國內(nèi)菌株,用于后續(xù)遺傳差異分析及致病機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

獼猴桃種植區(qū)的潰瘍病染病枝條采集于四川省都江堰市、雅安市、宜賓市、馬邊彝族自治縣,用于本研究中分離Psa病菌;獼猴桃品種‘紅陽’(Actinidiachinensiscv.‘Hongyang’)、煙草(Nicotianabenthamiana)植株均由本實驗室繁育種植, 用做潰瘍病菌接種植物材料。

FastPfu DNA Polymerase購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;Silwet L-77、a-萘乙酸、蛋白胨、6-芐氨基嘌呤、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、無水乙醇、甘油、蔗糖、瓊脂粉、瓊脂糖等,均為國外原裝或國產(chǎn)分析純試劑。

KB(King’s B)培養(yǎng)基:取蛋白胨20.0 g、磷酸氫二鉀1.5 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂15.0 g、甘油10 mL,溶于1 L去離子水中,121 ℃高壓滅菌15 min;MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基:取MS粉4.43 g、蔗糖20 g、瓊脂6 g,溶于1 L去離子水中,調(diào)節(jié)pH值至5.8;獼猴桃組培苗繼代培養(yǎng)基:取1 L MS培養(yǎng)基,高溫高壓滅菌后,冷卻至55 ℃左右加入1 mg/mL 6-芐氨基嘌呤溶液1 mL、1 mg/mL a-萘乙酸溶液300 μL,分裝于組織培養(yǎng)瓶備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌的分離純化與鑒定

將有明顯潰瘍病癥狀的獼猴桃采集枝條進行韌皮部取樣,加入無菌水充分研磨,取上清,涂布于KB培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)36～48 h。選取具有丁香假單胞菌形態(tài)的細(xì)菌單菌落,進行多次KB平板劃線培養(yǎng),并將所獲得的純化菌落與已鑒定的Psa菌株(ScMcH、ScPzH)[17]進行形態(tài)學(xué)比較。

利用已報道的Psa病原菌特異引物[18]Psa-F1(TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT)、Psa-R2(CACGCACCCTTCAATCAGGATG),對純化菌株進行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)。

分別對所擴增16S-23S DNA片段進行測序,然后將測序序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.2.2 ‘紅陽’ 獼猴桃組織培養(yǎng)

取獼猴桃嫩莖為外植體材料,無菌處理后,將外植體置于MS培養(yǎng)基中生長,獲得無菌苗。每隔約20 d進行1次繼代培養(yǎng),獲得獼猴桃組培苗。組培室培養(yǎng)條件如下:溫度為22 ℃,光照為3 500 lux,12 h光照/12 h黑暗。

1.2.3 潰瘍病菌致病性檢測

將分離純化的Psa菌株劃線于KB培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)36～48 h,以10 mmol/L MgCl2溶液分別稀釋成2×1010CFU(colony forming units)的細(xì)菌懸浮液,向其中添加Silwet L-77(體積分?jǐn)?shù)為0.025%)。取長勢健康的獼猴桃組培苗浸沒于上述細(xì)菌懸浮液中3 min[19],取出獼猴桃組培苗,于培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12 d,觀察發(fā)病情況。以10 mmol/L MgCl2溶液平行處理的組培苗為負(fù)對照,實驗獨立重復(fù)3次,每個菌株侵染3～5株獼猴桃組培幼苗。

在侵染1 d后取出獼猴桃組培苗,進行拍照和菌落計數(shù)。按植株質(zhì)量加入相應(yīng)體積10 mmol/L MgCl2溶液,充分研磨,吸取上清液。將上清液以10 mmol/L MgCl2溶液進行梯度稀釋。取稀釋后菌液5 μL涂布于KB培養(yǎng)基表面,28 ℃培養(yǎng)36～48 h,進行平板菌落計數(shù)。實驗獨立重復(fù)3次,計數(shù)結(jié)果利用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 煙草葉片超敏反應(yīng)

將KB培養(yǎng)基活化的Psa菌株以10 mmol/L MgCl2溶液分別稀釋為1×107、5×108CFU的細(xì)菌懸液。以無針頭的1 mL無菌注射器將Psa菌液進行煙草葉片注射,并以MgCl2為負(fù)對照,對Psa菌株在煙草葉片中的超敏反應(yīng)進行觀察和拍照記錄。實驗獨立重復(fù)3次,每個菌株注射3個煙草葉片。

2 結(jié)果分析

2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離分析

利用不同采集點獲得的具有潰瘍病癥的獼猴桃枝條,按1.2.1所述實驗方法進行病原分離。經(jīng)多次劃線純化,初步獲得了6個具有Psa形態(tài)特征的菌株。按照采樣地點及樣品植株品種,將所分離菌株分別命名為ScDjyH2、ScDjyH3(分離于四川都江堰種植區(qū)‘紅陽’獼猴桃30°99′N,103°65′E)、ScMbJ1(分離于四川馬邊彝族自治縣種植區(qū)‘金桃’獼猴桃 29°01′N,103°48′E)、ScYaH2(分離于四川雅安市種植區(qū)‘紅陽’獼猴桃30°15′N,102°95′E)、ScYbH1 (分離于四川宜賓市種植區(qū)‘紅陽’獼猴桃 28°76′N,104°40′E)、ScYbH2(分離于四川宜賓市種植區(qū)‘紅陽’獼猴桃 28°75′N,104°64′E)。

純化菌株在KB培養(yǎng)基上生長時,呈現(xiàn)為白色、圓形、光滑、微凸起、半透明狀菌落,與已測序鑒定的Psa菌株ScMcH[17]具有相同形態(tài)學(xué)特征,如圖1所示。圖1中:左側(cè)為Psa菌株ScDjyH2;右側(cè)為Psa菌株ScMcH。

圖1 分離菌株在KB培養(yǎng)基生長形態(tài)

2.2 分離菌株的PCR鑒定

利用Psa病原菌特異引物Psa-F1、Psa-R2,分別以6個分離菌株的單克隆培養(yǎng)菌液為模板,進行PCR鑒定,結(jié)果如圖2所示。圖2中:M為DNA marker;1～6依次為ScYbH1、ScYbH2、ScMbJ1、ScDjyH2、ScDjyH3、ScYaH2菌落擴增產(chǎn)物;+為正對照,ScMcH菌落擴增產(chǎn)物;-為負(fù)對照,未加入Psa的擴增產(chǎn)物。

圖2 分離菌株的PCR鑒定

從圖2可以看出,6個分離菌株均顯現(xiàn)陽性擴增片段(約280 bp),片段大小與對照菌株ScMcH相同,而未加入Psa菌液的負(fù)對照則未顯示擴增條帶。

進一步將各分離菌株的PCR擴增產(chǎn)物進行測序,并將所測定序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。結(jié)果表明,所分離菌株的序列片段均與已登錄Psa菌株具有最高相似性。其中ScDjyH2菌株P(guān)CR擴增測序片段的Blast比對結(jié)果如圖3所示。

圖3 ScDjyH2菌株P(guān)CR擴增測序片段的Blast比對

本文所分離的ScDjyH2與已報道的Psa菌株FJ29(中國科學(xué)院植物病理學(xué)研究室福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護重點實驗室分離)的16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer序列完全一致。通過分子鑒定可知,所分離6個菌株為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種。

2.3 Psa菌株對獼猴桃的致病性檢測分析

為檢測本實驗所分離Psa菌株對宿主獼猴桃的致病能力,分別將6個菌株按1.2.3所述方法制備懸浮菌液后,進行‘紅陽’獼猴桃組培幼苗的侵染。約10 d后,ScYbH2侵染的幼苗出現(xiàn)大面積褐色病斑,部分葉片從莖上脫落;ScDjyH2、ScYbH1侵染植株也顯現(xiàn)感染癥狀,葉片有明顯病斑;而ScMbJ1、ScDjyH3、ScYaH2侵染獼猴桃與MgCl2溶液處理的對照植株整體表型相似,無明顯感染,僅在ScMbJ1侵染植株部分葉片出現(xiàn)小病斑,如圖4所示。

圖4 Psa菌株侵染‘紅陽’獼猴桃組培10 d幼苗

進一步將侵染處理10 d的獼猴桃植株按1.2.3所述方法進行組織取樣、研磨及菌落計數(shù),結(jié)果如圖5所示。

1.MgCl2 2.ScDjyH2 3.ScDjyH3 4.ScMbJ1 5.ScYaH2 6.ScYbH1 7.ScYbH2

從圖5可以看出:MgCl2溶液處理植株中未有Psa菌落生長;顯示明顯病癥的ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1侵染植株組織中的Psa菌落數(shù)分別為188×104、79×104、63×104CFU/g;ScMbJ1接種植株中Psa菌落數(shù)平均值為23×104CFU,而ScDjyH3、ScYaH2接種獼猴桃體內(nèi)僅檢測到很少量病原菌,與對照處理植株無顯著性差異。圖5中,不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

由Psa菌株侵染接種后植株癥狀及菌落計數(shù)結(jié)果可知,本實驗所分離菌株對宿主獼猴桃顯示不同的致病性,其中:ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1具有較強致病性,其致病能力從大到小依次為ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1,后兩者致病能力相差不大;ScDjyH3和ScYaH2則為弱致病菌株;ScMbJ1可使侵染植株體內(nèi)有一定數(shù)目的病原菌增殖,具有一定致病性,雖與ScDjyH3和ScYaH2無統(tǒng)計學(xué)差異,但仍顯現(xiàn)與兩者不同。

2.4 Psa菌株的煙草葉片超敏反應(yīng)

基于病原菌侵染細(xì)胞時所釋放毒性效應(yīng)蛋白對植物免疫系統(tǒng)的激活作用,利用煙草葉片系統(tǒng)可以快速檢測植物對丁香假單胞病原菌的防御反應(yīng)[20]。因此,除了如上述接種侵染宿主植物獼猴桃,還可通過將Psa菌液在煙草葉片中進行注射,進一步檢測其免疫超敏反應(yīng)激活能力。

將6個Psa分離菌株、2個對照菌株ScMcH、ScPzH以及MgCl2對照分別制備溶液,在同一煙草葉片上進行注射,觀察注射部位植物組織的超敏反應(yīng),如圖6所示。

1.MgCl2 2.ScPzH 3.ScDjyH3 4.ScYaH2 5.ScYbH2 6.ScDjyH2 7.ScMbJ1 8.ScYbH1 9.ScMcH

從圖6可以看出,當(dāng)注射Psa菌液(1×107CFU) 24 h后,開始在部分菌株的注射部位出現(xiàn)葉片組織壞死,至72 h時,注射接種ScYbH2、ScDjyH2、ScMbJ1的葉片區(qū)域顯現(xiàn)細(xì)胞壞死超敏反應(yīng),但ScYbH1、ScDjyH3、ScYaH2未激活超敏反應(yīng)。當(dāng)注射菌液菌落數(shù)升至5×108CFU,ScYbH1也在72 h出現(xiàn)注射區(qū)域細(xì)胞壞死,而ScDjyH3、ScYaH2即使在高濃度長反應(yīng)時間仍未能激活煙草葉片免疫超敏反應(yīng)。

煙草免疫系統(tǒng)的激活反應(yīng)狀態(tài)與病原菌的致病性有一定關(guān)聯(lián),提示丁香假單胞病原菌是否向感染細(xì)胞釋放植物可識別的毒性致病因子,從而導(dǎo)致植物激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)感染部分細(xì)胞壞死超敏反應(yīng),限制病原菌的定植與傳播。檢測結(jié)果表明,本實驗所分離Psa菌株具有不同的超敏反應(yīng)激活能力。同時,注射于同一葉片的對照菌株ScPzH、ScMcH分別顯示未激活、激活超敏反應(yīng)表型[17],MgCl2對照注射處理部位也無超敏反應(yīng)發(fā)生,標(biāo)示煙草葉片免疫超敏反應(yīng)的穩(wěn)定性和靈敏性。

3 討 論

獼猴桃是一種重要的新興經(jīng)濟作物,由于果實品質(zhì)優(yōu)異,隨市場需求其種植面積和產(chǎn)量也在不斷增加。目前,全世界每年生產(chǎn)(150～160)×104t獼猴桃,其中中國、新西蘭和意大利占全球獼猴桃產(chǎn)量的90%[21-22]。我國是獼猴桃屬植物的起源分布中心,野生資源豐富,具有獨特的育種和栽培優(yōu)勢,也逐漸成為世界主要獼猴桃種植區(qū)[3]。但近年來,由Psa導(dǎo)致的潰瘍病害已成為世界范圍獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要威脅[23-24],尤其是近期田間新分離Psa菌株已顯示對防治潰瘍病最常用的銅殺菌劑、鏈霉素產(chǎn)生抗性,迫切需要研發(fā)基于致病機制的新的防治措施。

本文利用不同種植區(qū)染病獼猴桃進行Psa病原菌分離純化與鑒定,獲得了6個新的菌株。雖然形態(tài)學(xué)特征一致,但這些菌株顯示了不同的致病能力。在致病性檢測中選用中華獼猴桃紅果品種‘紅陽’的組培幼苗,‘紅陽’是我國近年培育的優(yōu)良紅肉品種,但它對潰瘍病菌不具抗性。利用幼苗浸泡進行病原接種,操作便捷,并可在較短時間內(nèi)觀察到染病癥狀,適用于Psa致病性或獼猴桃種質(zhì)抗性的快速檢測。獼猴桃為雌雄異株植物,利用雜交種子獲取幼苗時可能會由于授粉雄株不同而導(dǎo)致實生苗遺傳背景差異。通過組織培養(yǎng)營養(yǎng)繁殖則可保證實驗植物材料的遺傳一致性,且組培苗的無菌培養(yǎng)特性,也可避免病原接種實驗中其他細(xì)菌或真菌的干擾。

在對本文所分離Psa菌株的檢測中,ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1顯示較強致病性,ScMbJ1具有一定的植株體內(nèi)增殖能力,而ScDjyH3和ScYaH2則為弱致病菌株。在國外分離的2個弱致病菌株,發(fā)現(xiàn)其可能由于丁香假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控基因hrpR/hrpS的插入突變,抑制了毒性效應(yīng)蛋白的表達[25]。本課題組前期在我國獼猴桃種植區(qū)鑒定了另一獨立突變事件:在hrpR基因內(nèi)插入1 662 bp 的DNA移動元件,可使其讀碼框提前終止于插入序列中的終止密碼,從而影響病原菌致病力[17]。在本文中,新分離菌株在宿主獼猴桃致病性、煙草免疫超敏反應(yīng)中的多程度差異表型,提示Psa在快速傳播中進化形成了豐富的遺傳多樣性。其中,分離于都江堰、雅安兩地的ScDjyH3、ScYaH2菌株不具有明顯的獼猴桃致病性,也不能激活煙草超敏反應(yīng);分離于馬邊彝族自治縣的ScMbJ1顯示較弱的獼猴桃致病力,但可在低濃度條件下激活煙草超敏反應(yīng);而ScYbH1具有較強獼猴桃致病性,但卻在較高濃度下才激活煙草超敏反應(yīng)。這些田間來源不同、表型多樣的變異株將為后續(xù)潰瘍病菌致病基因及其機制研究提供重要基礎(chǔ)。