摘要：為了有效控制惡性雜草，深入剖析惡性雜草的成災(zāi)動力學(xué)，揭示其抗藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，并進(jìn)而探索和開發(fā)新型除草劑作用靶標(biāo)，強(qiáng)化對雜草分子生物學(xué)的系統(tǒng)性研究顯得尤為迫切。本文聚焦于植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在雜草中的應(yīng)用，旨在構(gòu)建一個全面高效的雜草遺傳轉(zhuǎn)化體系，以深入分析和驗證雜草基因功能。研究遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的主要方法包括生物介導(dǎo)法和非生物介導(dǎo)法。在生物介導(dǎo)法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高，但同時也存在基因型的差異和轉(zhuǎn)化條件的限制；植物病毒介導(dǎo)法不僅能進(jìn)行高效的表達(dá)和基因組編輯，還能從單一病毒的基因組中產(chǎn)生多個sgRNA，進(jìn)而達(dá)到多目標(biāo)的基因組編輯效果，但在植物病毒載體的穩(wěn)定性上存在一些不足之處。在非生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法中，基因槍法的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，這項技術(shù)不受宿主的限制，可以作用的受體細(xì)胞范圍非常廣泛，但是轉(zhuǎn)化效率低，成本也較高。此外，納米顆粒介導(dǎo)、無組織培養(yǎng)技術(shù)，以及利用Bbm/Wus2發(fā)育調(diào)控因子或REF1再生因子等新興技術(shù)，不僅為簡化植物組織培養(yǎng)流程、提高遺傳轉(zhuǎn)化效率提供新的思路，而且為建立高效的雜草遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)，為未來雜草的分子生物學(xué)研究和遺傳改良開辟了新的方向。

關(guān)鍵詞：雜草；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌；植物病毒；基因槍；新技術(shù)

中圖分類號：S451；Q943.2" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" 文章編號：1003-935X（2024）04-0001-10

Research Progress and Prospect of Plant Genetic Transformation Technology in Weeds

CHEN Xuan1，HUANG Ting1，WANG Lifeng^1，2，WU Di2，YANG Haona2

（1.Long Ping Branch，Graduate School of Hunan University，Changsha 410125，China； 2.Hunan Academy of Agricultural

Sciences/Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Weed，Changsha 410125，China）

Abstract：In order to effectively control malignant weeds，it was particularly urgent to delve into the dynamics of weed infestation，uncovered the molecular mechanisms underlying their resistance to herbicides，and explored and developped new targets for herbicide action，thereby enhancing systematic research in weed molecular biology. This review focused on the application of plant genetic transformation technology in weeds，aiming to construct a comprehensive and efficient weed genetic transformation system for in-depth analysis and verification of weed gene functions. Biological and non-biological mediated methods are the main research approaches in genetic transformation technology. Among the

收稿日期：2024-09-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：32302387）；湖南省自然科學(xué)基金（編號：2023JJ40368）；湖南省重點研發(fā)計劃（編號：2024AQ2035）；湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金（編號：2024CX70、2024CX01）。

作者簡介：陳 玄（2001—），女，湖南瀏陽人，碩士研究生，主要從事雜草生物學(xué)與防控研究。E-mail：2572441610@qq.com。

通信作者：楊浩娜，博士，助理研究員，主要從事雜草抗藥性研究。E-mail：haonayang@hunaas.cn。

biological methods，Agrobacterium-mediated transformation is simple to operate with a high transformation efficiency，but it also has issues such as differences in genotype and limitations in transformation conditions；plant virus-mediated methods can not only achieve efficient expression and genome editing but also produce multiple sgRNAs from the genome of a single virus，thus achieving multi-target genome editing effects，but there are some deficiencies in the stability of plant virus vectors. Among non-biological mediated transformation methods，the gene gun method has been quite mature，this technology is not limited by the host，and the range of recipient cells it can act on is very broad，but the transformation efficiency is very low，and the cost is also high. In addition，this article also provides a comprehensive review of some emerging technologies，including nanoparticle-mediated，tissue culture-free techniques，and the use of Bbm/Wus2 developmental regulators or REF1 regeneration factors，etc. These technologies not only provide new ideas for simplifying plant tissue culture processes and improving genetic transformation efficiency but also provide a theoretical basis and practical guidance for establishing an efficient weed genetic transformation system，opening up new directions for future molecular biological research and genetic improvement of weeds.

Key words：weed；genetic transformation；Agrobacterium；plant viruses；gene gun；new technologies

雜草是威脅作物安全生產(chǎn)的重要有害生物。在長期的管理實踐中，化學(xué)除草劑的不當(dāng)應(yīng)用，加上對雜草分子抗性機(jī)制理解的不足，導(dǎo)致雜草抗藥性問題日益嚴(yán)峻。我國農(nóng)作物受雜草危害嚴(yán)重，是全世界受影響最大的國家之一。據(jù)報道，我國農(nóng)田種植面積的85%受雜草危害，目前農(nóng)田雜草已超過1 430種（變種），造成糧食減產(chǎn)近300萬t/年，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2 200億元/年^［1］?；瘜W(xué)除草劑是目前農(nóng)田雜草防控的主要手段。隨著輕簡化栽培技術(shù)的大面積推廣應(yīng)用和長期大量化學(xué)除草劑的不科學(xué)使用，加上農(nóng)用機(jī)械大范圍跨區(qū)域作業(yè)等作物栽培模式和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式的改變，農(nóng)田草相由起初相對平衡的狀態(tài)逐步演化成種類繁多、危害隱蔽性強(qiáng)、分布不均、優(yōu)勢種群抗性嚴(yán)重的復(fù)雜局面。隨之，雜草科學(xué)研究工作愈加重要，尤其需要突破當(dāng)前惡性雜草適應(yīng)性及致害性機(jī)制不明、抗藥性嚴(yán)重但分子機(jī)理不清、除草劑新型靶標(biāo)匱乏等研究瓶頸，為雜草綠色高效防控提供理論依據(jù)。

在分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)被視為不可或缺的工具。然而，相較于作物而言，落后的雜草遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，制約了關(guān)鍵基因的挖掘與功能驗證等雜草分子生物學(xué)的研究。因此，急需應(yīng)用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建完整而高效的雜草遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并對雜草基因功能進(jìn)行分析和驗證，以期在惡性雜草成災(zāi)機(jī)制、雜草抗藥性機(jī)理、新型除草劑靶標(biāo)挖掘等研究方面提供有力技術(shù)支撐，進(jìn)一步推動雜草防控技術(shù)的研發(fā)。另外，雜草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，有利于發(fā)掘雜草高繁殖力、強(qiáng)抗逆性等功能基因，為作物高產(chǎn)、抗逆品種的遺傳改造提供基因材料，加速作物優(yōu)良品種培育進(jìn)程。

本文對生物介導(dǎo)法中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法，非生物介導(dǎo)法中的基因槍法進(jìn)行了深入分析，并特別關(guān)注這些技術(shù)在雜草研究中的應(yīng)用和關(guān)鍵進(jìn)展。最后，對目前關(guān)于遺傳轉(zhuǎn)化的新技術(shù)進(jìn)行綜述，包括納米顆粒介導(dǎo)法、無組織培養(yǎng)技術(shù)、利用Bbm/Wus2發(fā)育調(diào)控因子或REF1再生因子等，并期望未來這些技術(shù)在雜草建立遺傳轉(zhuǎn)化體系時提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。

1 生物介導(dǎo)法

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法多以植物分生組織及生殖器官為受體，通過導(dǎo)入外源基因，再利用組織培育轉(zhuǎn)基因植物，對轉(zhuǎn)基因植物后代進(jìn)行抗生素篩選和分子檢測等技術(shù)鑒定，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因材料。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在增加外源基因效率、減少拷貝量、減少沉默率、方便標(biāo)記基因檢測方面有一定優(yōu)勢。因此，這一技術(shù)對植物生理分子機(jī)理的驗證、作物農(nóng)藝性狀的改良等方面起到了積極作用^［2］。

在基因工程領(lǐng)域，根癌農(nóng)桿菌常被應(yīng)用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化^［3］。由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雜草遺傳轉(zhuǎn)化方法存在物種基因型的差異和轉(zhuǎn)化條件的限制，因此科學(xué)家們試圖通過不斷優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化條件，打破雜草的各種局限，以探尋通用、快速、高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法。由表1可知，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)在黑麥草、牛筋草、狗尾草、棒頭草、二穗短柄草、鼠鞭草、紫蘇草等一些雜草研究中得到應(yīng)用。

黑麥草屬異花傳粉植物，其離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定，難以重復(fù)結(jié)果。王奇麗等改變了農(nóng)桿菌侵染受體材料的方式，通過浸染、負(fù)壓處理相結(jié)合的方法侵染黑麥草成熟胚性愈傷組織，成功地將報告基因GUS、抗除草劑基因BAR轉(zhuǎn)移到多年生黑麥草中，使多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因平臺初步建立起來^［4］。通過對轉(zhuǎn)化過程中的菌株濃度、侵染時間以及植物激素和抗生素的類型、培養(yǎng)時間等進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了牛筋草^［8］、棒頭草^［9］、鼠鞭草^［10］的遺傳轉(zhuǎn)化體系。趙輝等對狗尾草的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行改良，以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了微量元素ZnSO4、CuSO4，成功地構(gòu)建和優(yōu)化了狗尾草胚性愈傷的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)^［11］。在此研究中他還發(fā)現(xiàn)，狗尾草成熟胚為外植體時，在光照條件下培養(yǎng)1周后再轉(zhuǎn)為暗培養(yǎng)，能大大提高種子胚性愈傷的誘導(dǎo)率。Yu等發(fā)現(xiàn)，新的化學(xué)誘導(dǎo)劑FPX（對氯苯乙酸衍生物）可以顯著提高二穗短柄草轉(zhuǎn)化過程的效率，由此突破了二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化過程中多采用未成熟胚胎，且只對植物生長有限時間窗口內(nèi)進(jìn)行培育的限制，研發(fā)了一種基于成熟胚胎的遺傳轉(zhuǎn)化方法，使得7周齡胚胎的遺傳愈傷組織轉(zhuǎn)化效率高達(dá)52.6%^［12］。FPX為一種有用的調(diào)節(jié)化合物，在愈傷組織形成、芽再生和農(nóng)桿菌感染中發(fā)揮化學(xué)誘導(dǎo)劑的作用^［15］。農(nóng)桿菌菌株和外植體類型在轉(zhuǎn)化過程中也起著重要作用。研究證實，含有各種質(zhì)粒的 C58C1 菌株對許多經(jīng)濟(jì)植物轉(zhuǎn)化具有適用性^［16］。而芽尖外植體是有效的外植體，在此前應(yīng)用于其他具有重要經(jīng)濟(jì)意義的植物（如玉米^［17］、棉花^［18］等）的遺傳轉(zhuǎn)化研究。Bakhsh等利用C58C1菌株以及紫蘇草外植體應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化研究，并通過GUS染色技術(shù)證實轉(zhuǎn)基因在外植體中的表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化效率可達(dá)55.13%^［14］。

盡管目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在雜草遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中得到了較為廣泛的應(yīng)用，但其在使用過程中會因植物的基因型差異對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生較大影響，也會因培養(yǎng)基組分、外植體狀態(tài)的不同，產(chǎn)生互作效應(yīng)而影響轉(zhuǎn)化效率^［19］。因此，在使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法處理棒頭草、鼠鞭草時，轉(zhuǎn)化效率并不理想。此外，在稗（Echinochloa crusgalli L.）、千金子（Euphorbia lathyris L.）等常見性有害雜草中，這種方法尚未被報道過。

1.2 病毒介導(dǎo)法

在植物中進(jìn)行基因編輯時，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅受限于植物寄主類型，而且T-DNA隨機(jī)整合到編輯植物的基因組中也帶來了轉(zhuǎn)基因監(jiān)管和生物安全問題。因此，各種植物病毒已經(jīng)被設(shè)計成可以容納和傳遞CRISPR/Cas的微型載體來產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因和基因組編輯的植物^［20］。

病毒介導(dǎo)法是以病毒為載體，利用基因重組技術(shù)將外源目的基因?qū)胧荏w宿主細(xì)胞，進(jìn)而完成轉(zhuǎn)染實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。自基因工程問世以來，植物病毒一直被用作異源基因表達(dá)載體，它被設(shè)計為引導(dǎo)RNA輸送到穩(wěn)定表達(dá)核酸內(nèi)切酶的植物中，甚至是完整的基因組工程成分^［21-25］，從而促進(jìn)在組成型表達(dá)Cas9的植物中進(jìn)行基于CRISPR/Cas9的靶向基因組編輯（VIGE）。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，病毒介導(dǎo)法不受寄主的限制，以此可提高植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

由表2可知，經(jīng)過近30年的發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出利用多種DNA、RNA病毒的VIGE系統(tǒng)，并應(yīng)用于各種寄主植物，在基因組編輯方面取得了優(yōu)異的成果。

2015年，Yin等報道了利用甘藍(lán)卷葉病毒（CaLCuV）在過表達(dá)Cas9的煙草轉(zhuǎn)基因中實現(xiàn)sgRNA投送和高效基因編輯^［26］。2017年，Gil-Humanes等成功地利用小麥矮縮病毒（WDV）攜帶的CRISPR/Cas9核酸酶和修復(fù)模板，在小麥的原生質(zhì)體中進(jìn)行了基因編輯，這種方法的效率是非病毒傳播方式的12倍^［27］。2018年，Ali等將1個或多個sgRNA遞送到本氏煙草和擬南芥植物中，導(dǎo)致了靶向基因組位點的誘變，且發(fā)現(xiàn)豌豆褐變病毒（PEBV）的sgRNA遞送比基于煙草響尾蛇病毒（TRV）的遞送可產(chǎn)生更多的靶向突變^［28］。2019年，Gao等設(shè)計了大麥黃紋花葉病毒（BYSMV）載體，為在大麥植株和小褐扁桃（SBPH）中同時表達(dá)3種外來蛋白提供了多功能表達(dá)平臺^［29］。此外，BYSMV載體能夠在小麥、大麥、谷子、玉米等受到系統(tǒng)性感染的谷物的葉片和根系中穩(wěn)定地表達(dá)大約600個氨基酸的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）蛋白和紅色熒光蛋白。同年，Jiang等開發(fā)了一組基于甜菜壞死性黃靜脈病毒（BNYVV）的CRISPR/Cas9介導(dǎo)植物基因組編輯的向?qū)NA遞送系統(tǒng)，以在表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行基因編輯^［30］?？傮w來說，以BNYVV為載體，會促進(jìn)甜菜及相關(guān)植物各種蛋白質(zhì)基因的表達(dá)。Zhang等的研究表明，狗尾草花葉病毒（FoMV）可以同時表達(dá)Cas9、sgRNA和RNAi抑制因子p19，靶向編輯了非轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源的PDS^［31］。開花位點T RNA（FTRNA）先前已被證明，在與結(jié)合綠色熒光蛋白（GFP）的信使RNA融合時能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞間運動^［38］?；诖?，2020年Ellison等將融合到FTRNA序列的sgRNA克隆到煙草脆裂病毒（TRV）載體中，該載體可通過根癌農(nóng)桿菌感染遞送至植物，實現(xiàn)高效、多重編輯植物基因的技術(shù)^［32］。Ma等揭示了一種利用RNA負(fù)鏈病毒苦芭菜黃網(wǎng)病毒（SYNV）作為CRISPR/Cas9完整載體的投送技術(shù)，該方法不依賴于遺傳轉(zhuǎn)化，不需要對特定受體細(xì)胞和組織進(jìn)行分離，高效實現(xiàn)了可遺傳的基因編輯后代^［33］。2021年，Li等將大麥條紋花葉病毒（BSMV）介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于小麥，實現(xiàn)了高效、多重和可遺傳的基因編輯^［34］。同年，周冠彤等首次利用由棉花葉皺縮病毒（CLCrV）介導(dǎo)的VIGE體系，成功地編輯了多個棉花的內(nèi)源基因，并在棉花樣本中成功構(gòu)建了一個高效且快速的sgRNA篩選系統(tǒng)^［35］。Uranga等設(shè)計了馬鈴薯病毒X（PVX），構(gòu)建了一種在成年茄科植物中輕松表達(dá)多種sgRNA的載體^［36］。Luo等設(shè)計了感染大豆的蘋果潛伏病毒（ALSV）來攜帶和遞送sgRNA，容易操縱并有效地輸送到大豆植物細(xì)胞中，從而實現(xiàn)大豆的基因功能研究和性狀改良^［37］。

盡管病毒介導(dǎo)法在植物遺傳轉(zhuǎn)化中展現(xiàn)出巨大潛力，但其在雜草領(lǐng)域的應(yīng)用卻相對有限。這一局限性主要源于該技術(shù)目前存在的一些缺點：（1）植物病毒載體穩(wěn)定性相對較差，常常由于病毒基因的重組，導(dǎo)致外源基因的丟失。（2）病毒的載貨能力有限（通常為＜1 kb）。這是由于它們用于遞送基因編輯試劑（如Cas9）的一個主要缺點，因為過大的載貨量（約4.2 kb）會導(dǎo)致全身運動的喪失或貨物DNA的丟失^［39］。（3）病毒載體的接種方法較為昂貴和繁瑣。（4）可移動病毒載體本身存在一定的安全性問題^［40］。

在雜草防治領(lǐng)域，大穗看麥娘（俗稱黑草）因其對化學(xué)除草劑的抗性和在農(nóng)作物生長周期內(nèi)的快速繁殖能力，而成為一種極具挑戰(zhàn)性的雜草。這種雜草的廣泛分布和難以控制的特性嚴(yán)重威脅著農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了有效控制這一有害雜草，科學(xué)家們正致力于鑒定和利用控制其生長的關(guān)鍵基因^［41］。在2020年，研究人員就成功地使用BSMV（大麥條紋花葉病毒）、FoMV（狐尾花葉病毒）感染了黑草，實現(xiàn)了基因沉默和蛋白過表達(dá)^［42］。他們發(fā)現(xiàn)，通過VIGS技術(shù)降低黑草中PHYTOENE DESATURASE基因（AmPDS）的表達(dá)，可以導(dǎo)致葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象；通過VOX技術(shù)，在黑草中過表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），并觀察到綠色熒光。這些技術(shù)還成功地用于研究黑草對除草劑的抗性，特別是通過降低一個與除草劑抗性相關(guān)的基因AmGSTF1的表達(dá)，研究人員能夠使原本對除草劑有抗性的黑草變得敏感。該研究證明，VIGS、VOX技術(shù)不僅適用于谷物，也適用于其他難以轉(zhuǎn)化的植物，包括雜草?？傊?，盡管面臨挑戰(zhàn)，病毒介導(dǎo)法在雜草遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景仍然充滿希望。未來的研究可能會集中在提高病毒載體的穩(wěn)定性和載貨能力，簡化接種方法，并探索這些技術(shù)在更多雜草物種中的應(yīng)用潛力。

2 非生物介導(dǎo)法

2.1 基因槍法

基因槍法，又叫粒子轟擊細(xì)胞法，是利用加速裝置將包裹有外源基因的微粒導(dǎo)入受體細(xì)胞、組織或器官中，完成基因轉(zhuǎn)移的一種方法。外源基因進(jìn)入受體以后整合入受體基因組，并得到表達(dá)以達(dá)到轉(zhuǎn)化目的^［43］。相較于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，該技術(shù)無宿主限制，其能夠作用的目標(biāo)受體種類繁多，幾乎涵蓋了所有有分化潛能的組織或細(xì)胞。與病毒介導(dǎo)法相比，基因槍法利用的載體安全性更大，操作更為簡便。目前，鮮有雜草是通過基因槍法來建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的，但是除雜草外的一些植物在采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)時或多或少的有涉及到基因槍法。

例如，Klein等以洋蔥表皮細(xì)胞為試驗材料，用鎢粉包裹DNA、RNA作為子彈，通過基因槍裝置將其導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外源基因可在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)^［44］。這是第1項關(guān)于基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的成果。1990年以前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)被限制用于雙子葉植物；而隨著基因槍法的問世，它已經(jīng)成為外源基因轉(zhuǎn)入單子葉植物受體細(xì)胞的主要手段。自1988年Wang等利用基因槍成功轉(zhuǎn)化水稻懸浮細(xì)胞以來，通過基因槍技術(shù)多種含有不同外源基因的轉(zhuǎn)基因水稻陸續(xù)被開發(fā)^［45］。此后，Li等針對基因槍轉(zhuǎn)化效率較低的缺陷，對水稻的基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)作了進(jìn)一步改進(jìn)^［46］。1990年，Goedon-Kamm等采用基因槍技術(shù)將GUS報告基因、CAT選擇性基因?qū)胗衩讘腋〖?xì)胞系，并由此獲得能夠正常結(jié)實的玉米植株^［43］。1993年，Koziel等通過同樣的技術(shù)將Bt基因引入玉米幼胚，這些轉(zhuǎn)基因植株在溫室和大田中表達(dá)了高水平的CrylA（b），顯示出顯著的抗玉米螟效果，并且這種性狀在后代中也能穩(wěn)定遺傳，有效提升了玉米的抗蟲性^［47］。1992年，Vasil等首次利用基因搶技術(shù)，將GUS基因和抗除草劑基因?qū)胄←溑咝杂鷤M織中，由此獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株^［48］。

基因槍法作為一種高效的遺傳轉(zhuǎn)化手段，在農(nóng)作物遺傳改良領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用。然而，相對于農(nóng)作物，基因槍法在雜草遺傳轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用實例尚不多見。盡管如此，一些成功的案例為雜草的遺傳改良提供了新的思路。早在1998年，Chen等使用杜邦PDS-1000He裝置（DuPont Wilmington DE）在6.21 MPa或7.58 MPa的壓力下轟擊馬唐（Digitaria sanguinalis）愈傷組織2次，由此實現(xiàn)了馬唐的遺傳轉(zhuǎn)化，突破實現(xiàn)166.67%的再生效率^［13］，這也是基因槍法在雜草遺傳轉(zhuǎn)化體系上成功應(yīng)用的突破。1999，年Dalton等使用Spangenberg等的方法將質(zhì)粒DNA包被在金顆粒（Aldrich）上，并使用根據(jù)Finer等設(shè)計構(gòu)建的顆粒流轟擊懸浮細(xì)胞獲得再生二倍體黑麥草，該方法轉(zhuǎn)化效率可達(dá)50%以上^［5-7］。另一個值得注意的案例是羊草（Leymus chinensis），這是一種在中國北方和蒙古地區(qū)廣泛分布的多年生草本植物，是重要的牧草資源。由于雜草的競爭，羊草的生產(chǎn)遭受嚴(yán)重?fù)p失，非選擇性除草劑殺死雜草的同時也對羊草造成傷害。為了提高羊草對除草劑的耐受性，2005年科學(xué)家首次成功地將耐草銨膦（basta）的PAT基因通過基因槍法轉(zhuǎn)入中國羊草，實現(xiàn)了對羊草的遺傳改良，為羊草這一難以轉(zhuǎn)化的草本植物建立了有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，包括愈傷組織的誘導(dǎo)、基因槍轟擊、篩選和再生過程^［49］。

盡管基因槍法在提高雜草遺傳轉(zhuǎn)化效率方面展現(xiàn)出潛力，但其在實際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，基因槍通過機(jī)械方式傳遞DNA，這一過程可能對受體細(xì)胞造成傷害甚至死亡^［50］。其次，只有直接被微彈轟擊的細(xì)胞及其鄰近的少數(shù)細(xì)胞能夠表達(dá)目標(biāo)DNA，與其他轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，其效率較低。此外，基因槍在操作中可能會使多個攜帶DNA的微彈同時進(jìn)入1個受體細(xì)胞，導(dǎo)致外源基因多拷貝整合。最后，其使用的配件如金粉/鎢粉、飛行膜、阻擋網(wǎng)和可裂膜都是高成本的一次性進(jìn)口材料。由此看來，基因槍法在雜草遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景廣闊，但仍需克服一些技術(shù)和成本上的障礙。未來的研究應(yīng)致力于優(yōu)化基因槍法的操作條件，提高轉(zhuǎn)化效率，降低成本，并探索其在更多雜草物種中的應(yīng)用潛力。

3 新技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

納米顆粒是一種具有高度可調(diào)節(jié)的物理化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，能夠穿過植物細(xì)胞壁而無需使用任何外部力。Lyu等介紹了一種由納米顆粒介導(dǎo)的基因傳遞方法^［51］。相較于傳統(tǒng)的根瘤菌和顆粒轟擊介導(dǎo)的基因傳遞，納米顆粒具有低細(xì)胞毒性、易操作（例如無需去除細(xì)胞壁或昂貴的設(shè)備）、廣泛的宿主范圍適應(yīng)性以及傳遞各種生物分子（核酸、蛋白質(zhì)和調(diào)控活性分子）的能力。Mei等推出了一種名為RAPID的植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化技術(shù)^［52］。與傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法不同，該技術(shù)能夠高效地利用植物的再生能力，避免了必須通過組織培養(yǎng)的限制，極大地簡化了植物的遺傳轉(zhuǎn)化流程。此外，這種方法已經(jīng)在多種植物中得到了成功的應(yīng)用，證明了它的多樣性和廣泛的適應(yīng)性。朱健康團(tuán)隊進(jìn)一步改良cut-dip-budding（CDB）基因遞送系統(tǒng)，開發(fā)了一種適用于多肉植物的無組培遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)，該技術(shù)是將CDB基因遞送系統(tǒng)應(yīng)用于具有葉插繁殖能力的多肉植物而不限于根蘗性植物的又一新突破^［53］。Bbm、Wus2是植物干細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)控因子^［54］。最近報道了利用關(guān)鍵植物干細(xì)胞基因Bbm/Wus2來提高植物轉(zhuǎn)化效率的方法。通過操縱玉米轉(zhuǎn)錄因子Bbm、Wus2的異位表達(dá)，Lowe等提高了4種單子葉植物（玉米、高梁、水稻、甘蔗）通過根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的效率，從而促進(jìn)了體細(xì)胞胚發(fā)生^［55］?；诂F(xiàn)有對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究進(jìn)展，Cody等開發(fā)了2種方法，通過向雙子葉植物遞送Wus2、BBM或其他涉及細(xì)胞分裂素合成的發(fā)育調(diào)節(jié)因子（developmental regulators，簡稱DR），來誘導(dǎo)分生組織，進(jìn)而實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化^［56］。而這2種方法可以通過將DR和攜帶特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒和/或基因編輯試劑進(jìn)行共同的遞送，進(jìn)而在誘導(dǎo)產(chǎn)生的新分生組織中實現(xiàn)植物的轉(zhuǎn)基因過程，且這種對靶標(biāo)基因的修飾可以進(jìn)行后代的遺傳。近日研究發(fā)現(xiàn)，不僅植物干細(xì)胞中的基因Bbm/Wus2可以提高植物的轉(zhuǎn)化效率，植物的再生因子REF1也顯示出明顯的提升作用。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李傳友教授團(tuán)隊通過研究首次發(fā)現(xiàn)植物界的“再生指揮官”——REF1，它是引發(fā)組織修復(fù)和器官再生的原初受傷信號分子，在植物再生中發(fā)揮了巨大作用，并在植物轉(zhuǎn)基因、基因編輯領(lǐng)域有巨大應(yīng)用價值^［57］。

由此可見，科學(xué)家們已通過不斷探索，在水稻、高粱等植物中發(fā)現(xiàn)并建立了高效實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)，這將為未來雜草遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的改進(jìn)提供豐富且堅實的理論基礎(chǔ)。而相較于其他植物，目前雜草的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用并不完善的原因有2個方面：其一，雜草本身種群雜合多，基因型差異大，而對雜草分子機(jī)理研究少，對其基因組解析不徹底，大大限制了雜草的遺傳轉(zhuǎn)化；其二，傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在多方面限制與缺陷，針對前者，科學(xué)家們梳理了多組學(xué)平臺在雜草科學(xué)研究中的發(fā)展歷程，提出了雜草基因組研究的滯后性，揭示了多組學(xué)分析在雜草中應(yīng)用并不廣泛的缺陷^［58］。由此可見，雜草研究領(lǐng)域已認(rèn)識到雜草基因組學(xué)的重要性，通過解析雜草起源與進(jìn)化，對雜草進(jìn)行深入且廣泛的基因組學(xué)分析，可為研究惡性雜草的成災(zāi)機(jī)制、雜草的抗藥性機(jī)制以及新型除草劑的靶標(biāo)挖掘等方面提供堅實的理論支撐。而針對后者傳統(tǒng)技術(shù)限制，需要優(yōu)化現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，并借鑒多肉植物^［53］、單子葉植物^［55］等成功案例，應(yīng)用或改造新方法和技術(shù)。

4 總結(jié)與展望

本文介紹生物介導(dǎo)法中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、植物病毒介導(dǎo)法和非生物介導(dǎo)法中的基因槍介導(dǎo)法，這些方法都有其應(yīng)用的優(yōu)點及其局限性（表3）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高，且應(yīng)用廣泛。對于那些還未建立組培體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系研究尚處于空白狀態(tài)的雜草，建議首先參考親緣關(guān)系近作物的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法，基于這個方法對激素配比、侵染方法等方面進(jìn)行改進(jìn)，以探索適合該雜草的轉(zhuǎn)化條件?；驑尳閷?dǎo)法不受宿主的限制，可以作用的目標(biāo)受體種類非常豐富，幾乎包括了所有具有分化潛力的組織或細(xì)胞。因此，對于那些在嘗試農(nóng)桿菌介導(dǎo)法后仍未取得效果的雜草，可以考慮采用基因槍法，并選擇分化能力較強(qiáng)的愈傷或其他組織作為受體。病毒介導(dǎo)法能夠?qū)崿F(xiàn)高效的表達(dá)和基因組編輯，還能從單一病毒的基因組中產(chǎn)生多個sgRNA，進(jìn)而達(dá)到多目標(biāo)的基因組編輯效果。目前報道已經(jīng)成功遞送基因的病毒載體種類頗多，在嘗試了多種方法但仍轉(zhuǎn)化效率低的情況下，建議通過篩選合適的病毒株，并采用病毒介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，這些傳統(tǒng)方法也存在明顯的局限性，在很大程度上限制了在建立雜草再生系統(tǒng)和傳播外來基因方面的工作效率。此外，由于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身存在一定的缺陷，導(dǎo)致一些外源基因很難進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)或不能被正常表達(dá)。因此，科學(xué)研究者已經(jīng)開始探索改變基因傳遞的路徑、調(diào)整傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方式，并建議利用植物干細(xì)胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，以提高各種植物遺傳轉(zhuǎn)化的效率。為了解決傳統(tǒng)基因傳遞方式可能導(dǎo)致的植物細(xì)胞損傷的問題，科學(xué)家們提出了一種由納米顆粒介導(dǎo)的基因傳遞技術(shù)，該技術(shù)能夠在不依賴外部力量的前提下，將生物分子有效地傳遞到完整的植物細(xì)胞內(nèi)。因此，在處理一些難以轉(zhuǎn)化的雜草問題時，我們可以考慮采用納米顆粒介導(dǎo)的方法。為了解決傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法所帶來的長周期問題，可采用RAPID無組織培養(yǎng)方法^［52］，這種方法能夠更高效地利用植物的再生潛力，從而極大地簡化組織培養(yǎng)的整體流程。因此，對于那些組織再生效率高且生長周期較長的雜草，該方法應(yīng)被優(yōu)先考慮。為了解決遺傳轉(zhuǎn)化效率不高的問題，建議使用Bbm/Wus2基因^［55］或者再生因子REF1^［57］，它們在提高遺傳轉(zhuǎn)化效率方面都具有明顯效果。因此，無論是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)還是當(dāng)前研究熱點中的新技術(shù)，我們都可以借鑒、參考，同時也可以嘗試對新技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，使其能夠更好地應(yīng)用于雜草的遺傳轉(zhuǎn)化。

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