李培佳 閆 辰 2 侯冬強 李 敏 彭 凱 黃 文 曹俊明 趙紅霞

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所, 廣東省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究中心, 廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室,廣州 510640; 2. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430070; 3. 廣州飛禧特生物科技有限公司, 廣州 510640)

腸道是水生動物消化系統(tǒng)中的重要部位, 在機體營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程中發(fā)揮重要作用[1]。腸道致病菌及外源性致病性物質(zhì)會對宿主腸道健康造成影響, 在此過程中, 腸道黏膜可對其進行清除, 以保護腸道健康[2]。機體正常的生長性能與腸道的健康密切相關(guān), 當腸道結(jié)構(gòu)受到有害物質(zhì)及寄生蟲侵入, 腸道會發(fā)生炎癥及一系列的病理反應(yīng), 嚴重者會直接影響到腸道的生長發(fā)育甚至死亡[3]。水生動物腸道結(jié)構(gòu)及功能的完整性不僅反映腸道正常的消化吸收能力, 同時可以衡量腸道免疫功能的強弱[4]。水生動物腸道內(nèi)存在大量微生物群落, 微生物與宿主腸道形成一個動態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng), 其中, 腸道菌群的動態(tài)平衡與宿主健康密切相關(guān)[5]。腸道微生物群可以促進腸道蠕動和營養(yǎng)物質(zhì)消化, 一旦腸道微生物群失衡, 機體會發(fā)生疾病, 如腸炎[6]、腹瀉[7]和腸道應(yīng)激[8]等。感染腸炎會增加腸道的通透性, 更利于有害物質(zhì)進入到機體, 因此增強魚類腸道健康是保證魚類正常生長的重要保障。

水生動物生長性能與腸道健康密切相關(guān)。近年來, 由于集約化的養(yǎng)殖模式導致養(yǎng)殖密度大和水質(zhì)環(huán)境污染等現(xiàn)象, 引起水生動物腸道疾病, 從而造成生長性能下降[9]。研究表明, 飼料補充?；撬?Taurine)可以顯著增強斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)生長性能和腸道健康[10]、顯著緩解歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)腸道炎癥[11]和顯著增強了鯉(Cyprinus carpio)生長性能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和消化活性[12]。同時先前本實驗室研究表明, 在雜交鱧飼料中添加N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamic, NCG)可以顯著改善雜交鱧腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與腸道菌群豐度[13]。但是, 目前?；撬嵩谒鷦游锬c道菌群方面的研究較少, 關(guān)于飼料補充NCG和牛磺酸對魚類腸道結(jié)構(gòu)及腸道微生物群落的影響研究不深入, 開展此方面的研究很有必要。

雜交鱧(Channa maculata♀ ×C.argus♂), 是烏鱧和斑鱧的雜交子一代, 其在生長性能、抗病性和抗逆性方面均優(yōu)于親本[14]。目前珠三角主要鱧科養(yǎng)殖品種為雜交鱧, 據(jù)統(tǒng)計, 2021年珠三角雜交鱧養(yǎng)殖產(chǎn)量達到28.30萬噸[15]。NCG和?；撬嵩谒a(chǎn)動物促生長、提高抗氧化能力和免疫能力方面有大量研究, 但截至目前, 仍沒有關(guān)于牛磺酸對雜交鱧的研究, ?；撬釋λ鷦游锬c道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道菌群的影響少之又少。NCG和?；撬岫季哂性鰪娚L性能、改善腸道結(jié)構(gòu)的功能, 但二者的作用機制是否相似尚不清楚。綜上所述, 本文結(jié)合飼料補充NCG和?；撬釋﹄s交鱧生長性能影響的基礎(chǔ)上, 進一步研究NCG和?；撬釋﹄s交鱧腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化酶活性、抗氧化能力及腸道微生物群落的影響及作用機制, 旨在發(fā)現(xiàn)二者作用的異同, 為后續(xù)研究提供一定的參考, 本研究對雜交鱧的健康養(yǎng)殖及提高水生動物腸道保護機制方面具有重要的理論價值。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以玉米蛋白粉、豆粕和魚粉等配制蛋白為44%, 大豆油、磷脂油和魚油等配制脂肪為8%的基礎(chǔ)飼料。分別設(shè)計3個實驗組別: 對照組、N-氨甲酰谷氨酸組及?；撬峤M。NCG純度≥98%, 購自亞太興牧(北京)科技有限公司(北京, 中國)。?；撬峒兌取?8%, 購自希杰(沈陽)生物科技有限公司沈陽。本實驗室前期試驗確定雜交鱧飼料精氨酸適宜添加水平為0.03%左右[16], 因此本次試驗飼料NCG添加量為0.03%。研究顯示, 飼料添加1%?；撬崮茱@著提高翹嘴鲌(Culter alburnus)生長性能[17],飼料在不同階段添加1%—1.2%牛磺酸能顯著提高斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)增重率[18], 飼料添加1.15%?；撬崮茱@著提高大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)增重率[19], 因此本次試驗牛磺酸添加水平為1%。將不同的原料按照配方進行稱量, 并粉碎過60目篩, 逐級混合后拌水, 采用B20強力攪拌機進行混合, 混合后采用T52型膨化機制成膨化飼料,繼而將磷脂油、豆油和魚油進行混合并噴灑到膨化飼料上, 噴灑均勻后自然風干, 風干后陰涼保存?zhèn)溆?。飼料配方如?所示。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)成分(干重)Tab. 1 Experimental feed formula and nutrient composition (dry matter, %)

1.2 養(yǎng)殖管理

在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所白云實驗基地進行8周養(yǎng)殖實驗, 養(yǎng)殖用水曝氣后使用。從廣州市錦龍漁業(yè)有限公司購買雜交鱧魚苗。第一周在2.5 m×2.5 m×1.5 m的暫養(yǎng)網(wǎng)箱中暫養(yǎng), 每天08:00和16:00飽食投喂基礎(chǔ)飼料2次。暫養(yǎng)結(jié)束后禁食24h, 隨機挑選體格均勻(22.02±0.02) g, 活力旺盛的雜交鱧魚苗450尾。5個實驗組, 每個實驗組包含3個重復(50尾), 在1.5 m×1.5 m×1.5 m網(wǎng)箱中進行8周養(yǎng)殖實驗, 每天08:00和16:00飽食投喂實驗飼料2次。實驗期間溶氧濃度8 mg/L左右,pH 8.0左右, 氨氮濃度小于0.1 mg/L, 水溫為25—32℃。

1.3 樣品采集與指標測定生長指標計算公式

式中,F初為初始尾數(shù),F末為終末尾數(shù), CP初為初始魚體蛋白含量, CP末為終末魚體蛋白含量,W為體重,W初為初始魚重量,W末為終末魚重量, CP飼料為飼料蛋白含量,D總為攝入飼料總重,D為飼料攝入量,T為養(yǎng)殖時間。

實驗魚樣品采集與體成分測定在8周實驗結(jié)束后, 禁食24h。對每個網(wǎng)箱實驗魚進行測量, 將體重、體長等數(shù)據(jù)進行匯總, 并統(tǒng)計存活率及消耗飼料量。生長性能計算隨機挑取6尾魚, 放置于冰上迅速進行解剖, 3尾魚全腸進行消化酶和抗氧化指標的測定, 3尾魚后腸進行腸道菌群的測定。10%福爾馬林溶液固定3尾魚的腸道進行腸道切片的制作。飼料及魚體水分采用GB/T 6435-2014法測定、粗蛋白質(zhì)采用GB/T 6432-2018法測定、粗灰分采用GB/T 6438-2007法測定、粗脂肪采用GB/T 6433-2006法測定、魚體精氨酸采用GB/T 18246-2019法測定。

腸道消化酶和抗氧化酶活性測定淀粉酶(Amylase, AMS)、胰蛋白酶(Tryosim, TPS)、脂肪酶(Lipase, LPS)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase, γ-GT) 、Na+/K+ATP酶(Na+/K+ATPase) 、肌酸激酶(Creatine, CK) 、過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性、過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性、總抗氧化(Total antioxidant capacity, T-AOC)能 力、丙 二 醛(Malondialdehyd, MDA)含量及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase , GSH-Px)活性。酶活試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定步驟、原理和計算公式等參考試劑盒說明書。

腸道切片分析提取固定的腸道, 進行修剪和脫水處理, 采用石蠟包埋, 繼而進行組織切片和染色, 最后封片和鏡檢。鏡檢使用成像顯微鏡并且使用Case Viewer 2.2進行拍攝, 挑選不同的放大倍數(shù)中合格的切片并拍攝切片中的腸道病理變化。

腸道菌群采集每個重復組隨機取3尾魚腸道, 立即裝入2 mL凍存管中液氮速凍4h, 放置于-80℃保存, 用于檢測腸道菌群。

生物信息分析以16S DNA“V3+V4”設(shè)計引物序列, 引物序列為338F (5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′) and 806R (5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′), PCR 正式試驗采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20 μL反應(yīng)體系。采用分類單元(OTU)進行聚類和物種分析,基于OTU進行alpha多樣性分析, 對Coverage指數(shù)(Coverage index)測定其物種覆蓋度, 對Chao 指數(shù)(Chao index), Ace 指數(shù)(Ace index)測定腸道菌群豐度, 對Shannon 指數(shù)(Shannon index), Simpson 指數(shù)(Simpson index)測定腸道菌群多樣性。Illnmina腸道測序產(chǎn)生凈序列2177059, 平均序列長度450 bp。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 5 (美國)軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和繪制該實驗的結(jié)果圖(GraphPad Software U.S.A)。*表示組間差異顯著(P＜0.05),**表示組間差異極顯著(P＜0.001)。所有實驗均獨立重復3次,n=3。

2 結(jié)果

2.1 生長性能和體成分分析

與對照組相比, 0.03%NCG組和1%Taurine組PPV顯著升高, FCR和FI顯著下降(P＜0.05), IBW、WGR、FW、SGR、PE和魚體精氨酸含量無顯著性差異(P＞0.05); 與對照組相比, 0.03%NCG 組SR顯著升高(P＜0.05; 圖1)。

圖1 不同實驗組飼糧對雜交鱧生長性能的影響Fig. 1 Effect of different experimental groups of diet on the growth performance of Channa maculate ♀× C. argus ♂

2.2 腸道消化酶活性

與對照組相比, 0.03%NCG組和1%Taurine組雜交鱧腸道淀粉酶和肌酸激酶顯著升高(P＜0.05); 與對照組相比, 1%Taurine組雜交鱧腸道胰蛋白酶、脂肪酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和鈉鉀ATP酶顯著升高(P＜0.05); 與0.03%NCG組相比, 1%Taurine組雜交鱧腸道淀粉酶和鈉鉀ATP酶顯著升高(P＜0.05; 圖2)。

圖2 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道消化酶活性的影響Fig. 2 Effect of different experimental groups of diet on intestinal digestive enzyme activities of Channa maculata ♀× C. argus ♂

2.3 腸道抗氧化酶活性

與對照組相比, 0.03%NCG組雜交鱧腸道總抗氧化能力、過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶顯著升高, 丙二醛含量顯著下降(P＜0.05); 與對照組相比, 1%Taurine組雜交鱧腸道胰丙二醛含量顯著下降(P＜0.05); 與0.03%NCG組相比, 1%Taurine組雜交鱧腸道丙二醛含量顯著升高(P＜0.05; 圖3)。

圖3 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道抗氧化指標的影響Fig. 3 Effect of different experimental groups of diet on intestinal antioxidant index of Channa maculata ♀× C. argus ♂

2.4 腸道黏膜病理狀態(tài)

各實驗組雜交鱧腸道黏膜層、肌層結(jié)構(gòu)清晰、緊密, 黏膜層絨毛豐富, 較多絨毛上皮與固有層間隙增寬(黑色箭頭), 少量絨毛上皮斷裂(紅色箭頭), 腸腔亦見脫落的上皮細胞團塊(黃色箭頭), 未見其他明顯異常(圖4)。

圖4 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道病理切片的影響(左圖. 原始放大100×; 右圖. 原始放大200×)Fig. 4 Effect of different experimental groups of diet on the expression of intestinal pathological sections in Channa maculata ♀× C. argus♂ (left figure. original magnification 100×; right figure. original magnification 200×)

2.5 腸道結(jié)構(gòu)分析

與對照組相比, 0.03%NCG組雜交鱧前腸肌層厚度、中腸絨毛寬度、中腸肌層厚度和后腸肌層厚度顯著升高(P＜0.05); 與對照組相比, 1%Taurine組雜交鱧前腸絨毛長度、前腸絨毛寬度、前腸肌層厚度、中腸絨毛寬度、中腸肌層厚度、后腸絨毛寬度和后腸肌層厚度顯著升高(P＜0.05); 與0.03%NCG組相比, 1%Taurine組雜交鱧中腸肌層厚度和后腸肌層厚度顯著升高(P＜0.05; 圖5)。

圖5 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of different experimental groups on intestinal morphology and structure of Channa maculata ♀× C. argus ♂

2.6 腸道alpha多樣性分析

各實驗組Coverage指數(shù)均為1.00, 表明測序深度已經(jīng)完成腸道所有微生物物種檢測, 與對照組和相比, 1% Taurine組雜交鱧腸道Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯著升高(P＜0.05), 0.03% NCG組無顯著差異性(P＞0.05; 表2)。

表2 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道alpha多樣性的影響Tab. 2 Effect of different experimental groups on the expression of genes related to sugar metabolism in Channa maculata ♀× C.argus ♂

2.7 腸道微生物物種組成分析

雜交鱧腸道微生物在3個實驗組共鑒別出1454個OTU。對照組、0.03% NCG組和1% Taurine組OTU分別有289、332和833, 分別占總OTU的19.88%、22.83%和57.29%。其中1% Taurine組OTU顯著高于對照組和0.03% NCG組(P＜0.05; 圖6)。

圖6 不同實驗組飼糧對雜交鱧腸道微生物物種豐度占比的影響Fig. 6 Effect of different experimental groups on the abundance proportion of intestinal microbial species in Channa maculata ♀×C. argus ♂

如圖7和圖8所示, 在門水平上與對照組相比,0.03%NCG組和1% Taurine組厚壁菌群(Firmicutes)顯著升高, 梭桿菌群(Fusobacteriota)顯著降低(P＜0.05)。在屬水平上與對照組相比, 0.03%NCG組和1% Taurine組支原體屬(Mycoplasmataceae)顯著升高, 梭菌屬(Clostridium)顯著降低(P＜0.05)。

圖7 門水平上的群落豐度占比Fig. 7 Community abundance ratio at phylum level

圖8 屬水平上的群落豐度占比Fig. 8 Community abundance ratio at genus level

雜交鱧腸道微生物在門水平上選取前40個豐度高的菌群進行占比分析, 結(jié)果表明, 對照組和0.03%NCG組物種同源性及豐度占比相似, 與1%Taurine組成顯著差異(P＜0.05)。同時觀察到1%Taurine組在厚壁菌群豐度占比最高, 并顯著高于對照組和0.03%NCG組(P＜0.05; 圖9)。

圖9 門水平上前40個腸道微生物熱圖分析Fig. 9 Heat map analysis of the top 40 intestinal microorganisms at the phylum level

選取雜交鱧腸道微生物門水平上前40個菌落對比在線數(shù)據(jù)庫, 并通過KEGG途徑對每個微生物物種進行功能注釋。結(jié)果表明, 雜交鱧腸道微生物的功能主要用于氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝、糖類及能量的代謝與轉(zhuǎn)化等(圖10)。

圖10 基于KEGG途徑分析雜交鱧腸道微生物功能預(yù)測Fig. 10 Prediction of intestinal microbial function of Snakehead hybrid based on KEGG approach

3 討論

NCG在水生動物體內(nèi)可有效合成精氨酸、精氨酸作為水生動物必需氨基酸, 對水生動物的生長和維持氮平衡有重要作用[20]。而牛磺酸作為水生動物體內(nèi)條件性必需氨基酸, 是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物不可缺少的營養(yǎng)素[21]。在本實驗條件下, 飼料補充0.03%NCG和1%Taurine雜交鱧PPV顯著升高, FCR顯著下降, NCG組與Taurine組相比, FCR、FI和PPV無顯著差異, 這表明雜交鱧飼料補充NCG或?；撬峥梢燥@著增強蛋白沉積, 提高飼料利用效率, 降低養(yǎng)殖成本。這可能由于外源性補充NCG在水產(chǎn)動物體內(nèi)內(nèi)源性合成精氨酸代謝產(chǎn)生一氧化氮和多胺等物質(zhì), 一氧化氮促使雜交鱧吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì),多胺在雜交鱧體內(nèi)直接促進蛋白質(zhì)的合成[20]。值得注意的是, ?；撬嵩缭谙惹暗难芯恐斜蛔C明可以作誘食劑, 這也很好地解釋了雜交鱧飼料中補充了牛磺酸, 促使雜交鱧表現(xiàn)出較高的飼料利用效率和蛋白質(zhì)沉積率[22]。同時?；撬嶙鳛楹虬被? 在水生動物體內(nèi)可以促進多胺的合成, 有效合成體蛋白[23]。當然, 這也歸因于?；撬峥梢酝ㄟ^增強腸道消化酶的活性, 從而促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收, 并以最佳的生長性能做出反饋[24]。綜上所述, NCG和?；撬嵩诖龠M雜交鱧生長性能方面作用結(jié)果相似,原因可能與NCG和牛磺酸在雜交鱧體內(nèi)合成多胺有關(guān), 具體作用機制需進一步研究。

腸道消化酶包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶, 消化酶與腸道的生長發(fā)育相關(guān)[25]。Na-K+-ATP酶可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓, 促進葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)進入細胞內(nèi)代謝[26]。γ-GT在主要作用于多肽轉(zhuǎn)運, 為機體蛋白合成提供原料[27]。肌酸激酶主要與細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運、ATP再生有直接關(guān)系[28]。在本實驗條件下, 雜交鱧飼料補充NCG可以顯著提高腸道淀粉酶和肌酸激酶活性, 表明內(nèi)源性合成精氨酸可以增強雜交鱧腸道消化酶活性, 促進腸道內(nèi)能量轉(zhuǎn)運。這與建鯉(Cyprinus carpio var. Jian)[29]研究結(jié)果相同。同時觀察到, 雜交鱧飼料補充?；撬峥梢燥@著增高腸道胰蛋白酶、脂肪酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和鈉鉀ATP酶活性, 表明?；撬峥梢燥@著增強雜交鱧腸道消化酶活性, 提高腸道營養(yǎng)物質(zhì)交換和能量轉(zhuǎn)化效率, 促進營養(yǎng)物質(zhì)在消化道內(nèi)的吸收和代謝,這與黃河鯉[24]的研究結(jié)果相同, 同時可以有效地解釋了?；撬犸@著增強雜交鱧生長性能的原因。綜上, NCG和?；撬峥赏ㄟ^提高不同消化酶活性提高腸道能量轉(zhuǎn)化效率, 促進雜交鱧生長。

水生動物組織結(jié)構(gòu)會受到氧化損傷, 進而影響到水生動物的免疫機能[30]。水生動物在氧化應(yīng)激損傷過程中, 會釋放氧自由基, 主要包括超氧陰離子和羥自由基, 其能夠?qū)е滤鷦游锝M織上皮細胞脂質(zhì)氧化損傷, 進而產(chǎn)生丙二醛[30]。研究表明, 飼料補充NCG可以顯著增強黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)血清[31]和團頭魴(Megalobrama amblycephala)[32]腸道抗氧化活性。在本實驗條件下, 飼料補充NCG可以顯著提高雜交鱧腸道總抗氧化能力、過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性。這可能由于飼料補充NCG內(nèi)源性合成精氨酸, 進而使機體內(nèi)谷氨酰胺活性升高, 谷氨酰胺可以作為氧化物質(zhì)的能量來源, 從細胞中去除氧化化合物, 防止氧化損傷細胞組分[33]。值得注意的是, 飼料補充NCG雜交鱧腸道丙二醛含量顯著下降。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一, 可導致細胞損傷和功能障礙, 因此, 它被認為是氧化應(yīng)激的一個強有力的生物標志物[34]。本實驗結(jié)果表明, 飼料補充NCG可以有效降低雜交鱧腸道MDA含量, 并有效緩解腸道過氧化造成的細胞損傷, 本實驗結(jié)果在團頭魴中也得到證實[32]。同時觀察到, 雜交鱧飼料補充?；撬崮c道丙二醛含量顯著下降。這一點與黃顙魚[35]研究結(jié)果相同, 魚類可通過自身酶系統(tǒng)清除氧自由基, 緩解氧化損傷[36]。研究表明, 飼料補充?；撬峥梢蕴岣咧腥A絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[37]血清抗氧化活性、顯著提高歐洲鱸[38]腸道抗氧化活性。截至目前, 關(guān)于牛磺酸與魚類腸道中抗氧化酶關(guān)系研究較少, 更未涉及到抗氧化酶mRNA水平方面的研究, ?；撬峥赡軙ㄟ^影響魚類腸道抗氧化信號分子表達調(diào)控機體抗氧化進程, 因此, 在未來的研究中, 開展相關(guān)的研究很有必要。

腸道作為水生動物重要的營養(yǎng)物質(zhì)消化器官,是保證水生動物健康生長的保障[39]。外界環(huán)境中的細菌會對腸道結(jié)構(gòu)造成損壞, 引發(fā)腸炎及腸道相應(yīng)部位的損傷[40]。腸炎是水生動物養(yǎng)殖過程中的三大疾病之一, 嚴重危害魚的生長健康[41]。因此,增強魚類腸道健康是保證魚類生長性能的重要保障性因素。腸道絨毛和肌層厚度是保證腸道結(jié)構(gòu)完整發(fā)關(guān)鍵指標, 完整的腸道絨毛不僅可以促進消化物質(zhì)的吸收, 更有利于防止有毒物質(zhì)的入侵[42]。研究表明, 飼料補充精氨酸可顯著增強水生動物腸道絨毛寬度、改善腸道萎縮狀態(tài)[43], 飼料補充?；撬峥娠@著增強水生動物腸道消化酶和抗氧化酶活性、緩解腸道氧化損傷[44]。在本實驗條件下, 飼料補充NCG顯著增強雜交鱧前腸肌層厚度、中腸絨毛寬度、中腸肌層厚度和后腸肌層厚度, 飼料補充?；撬犸@著增強雜交鱧前腸絨毛長度、前腸絨毛寬度、前腸肌層厚度、中腸絨毛寬度、中腸肌層厚度、后腸絨毛寬度和后腸肌層厚度。本實驗結(jié)果很好地證明了NCG和牛磺酸在水生動物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮的重要作用。同時觀察到各實驗組雜交鱧腸道黏膜層、肌層結(jié)構(gòu)清晰、緊密, 黏膜層絨毛豐富, 對照組有較多絨毛上皮與固有層間隙增寬, 少量絨毛上皮斷裂, 腸腔亦見脫落的上皮細胞團塊, NCG組這些現(xiàn)象得到緩解, 表明飼料補充NCG內(nèi)源性合成精氨酸途徑可保護雜交鱧腸道結(jié)構(gòu)完整, 緩解病理損傷。這一原因可能是精氨酸可以促進多胺和生長激素的合成, 多胺對腸道修復起重要作用, 而生長激素能夠顯著減少腸黏膜萎縮,加速受損腸道修復[45]。

水生動物腸道微生物群落從動物出生就在腸道內(nèi)存在, 是機體內(nèi)最大的生態(tài)系統(tǒng)[46]。腸道微生物群落在腸道內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài), 這種平衡對于機體正常生理活動如營養(yǎng)物質(zhì)消化、代謝和抵御外來病原物質(zhì)入侵起關(guān)鍵作用[47]。腸道微生物群落平衡被打破、其正常的消化功能也會受損甚至引發(fā)腸道炎癥等一系列疾病[48]。在本實驗條件下,雜交鱧腸道菌群各實驗組Coverage指數(shù)均為1.00,表明測序深度已經(jīng)完成腸道所有微生物物種檢測。雜交鱧飼料補充?；撬崮c道Ace和Chao指數(shù)顯著升高, 表明?；撬岬难a充顯著增加了腸道菌群的豐富度, 改善了腸道菌群的穩(wěn)定性。同時觀察到,飼料補充?；撬犭s交鱧腸道菌群OUT占比為57.29%,顯著高于對照組和NCG組, 這表明?；撬岵粌H可以增強雜交鱧腸道菌群的豐富度, 更有效地增多了雜交鱧腸道微生物的數(shù)量, 保護腸道健康。

本實驗通過在門水平上選取前40個豐度高的菌群進行占比分析, 結(jié)果表明, ?；撬峤M與對照組間的微生物組成存在顯著差異性, 并顯著高于對照組, NCG組和對照組間腸道微生物物種同源性及豐度占比相似。值得注意的是, 飼料補充NCG和牛磺酸雜交鱧腸道厚壁菌門顯著升高, 梭桿菌門顯著降低。厚壁菌門是腸道中存在的主要細菌, 也是雜交鱧腸道微生物的優(yōu)勢菌群, 厚壁菌群的升高對腸道健康至關(guān)重要[49]。梭桿菌門可以從膳食纖維或淀粉中釋放能量, 但在分解蛋白過程中也會致使有毒產(chǎn)物的釋放[50]。同時觀察到, 飼料補充NCG和?；撬峤M腸道微生物群支原體屬顯著升高, 梭菌屬顯著降低。結(jié)果表明, 飼料補充NCG或?；撬峥梢燥@著增強腸道微生物的多樣性和豐富度, 促進腸道生長,維持腸道微生物群落動態(tài)平衡, 保護腸道健康。同時選取雜交鱧腸道微生物門水平上前40個菌落對比在線數(shù)據(jù)庫, 并通過KEGG途徑對每個微生物物種進行功能注釋。結(jié)果表明, 雜交鱧腸道微生物的功能主要用于氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝、糖類及能量的代謝與轉(zhuǎn)化等, 這些預(yù)測結(jié)果與NCG和?；撬釋λ鷦游锏拇偕L、增強消化酶和抗氧化酶活性和改善免疫調(diào)節(jié)能力相同。

4 結(jié)論

飼料中添加0.03% NCG或1% Taurine可顯著提高雜交鱧蛋白質(zhì)沉積率、提高腸道消化酶活性(淀粉酶和肌酸激酶)、改善腸道結(jié)構(gòu)(前腸肌層厚度、中腸絨毛寬度、中腸肌層厚度和后腸肌層厚度)、增強腸道菌群豐度(厚壁菌群和支原體屬), 顯著降低飼料系數(shù)和腸道丙二醛含量、顯著降低腸道梭桿菌群和梭菌屬豐度。此外, 飼料中添加0.03% NCG可顯著提高雜交鱧腸道總抗氧化能力(過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶)并顯著緩解腸道病理狀態(tài),飼料中添加1%Taurine可顯著提高雜交鱧腸道消化酶活性(胰蛋白酶、脂肪酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和鈉鉀ATP酶)、改善腸道結(jié)構(gòu)(前腸絨毛長度、前腸絨毛寬度和后腸肌層厚度)并顯著增強腸道菌群豐度。結(jié)果表明飼料中添加NCG在增強腸道抗氧化活性, 緩解腸道氧化損傷方面優(yōu)于添加?；撬? 但飼料添加?；撬峥梢栽鰪娔c道消化酶活性, 促進腸道生長, 其作用效果優(yōu)于補充NCG。